蜕皮激素对棉铃虫抗菌肽表达的调控研究

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昆虫生长发育受到多种激素的调控。蜕皮激素(20-Hydroxyecdysone,20E)是昆虫蜕皮变态过程中的关键激素,越来越多的研究报道20E与昆虫先天免疫有一定的联系,特别是在对抗菌肽(antimicrobial peptide,AMP)的调控中起到一定作用。为了抵御外源微生物的入侵,昆虫形成了细胞免疫和体液免疫。在体液免疫中,AMPs的产生至关重要,AMPs的表达受Toll和IMD两条信号通路调控,NF-κB转录因子Dorsal和Relish分别在Toll和IMD两条信号通路中参与昆虫先天免疫。为了探究20E对棉铃虫抗菌肽的调控作用,本论文统计了不同时期棉铃虫感染细菌后的存活率;通过实时荧光定量PCR(Real-time qPCR,qRT-PCR)检测不同时期棉铃虫免疫相关基因表达水平,利用Western blot检测Dorsal和Relish的蛋白水平;同时检测了不同时期棉铃虫血淋巴中20E滴度变化;对取食期棉铃虫注射20E后再感染细菌并检测细菌菌落数(Colony forming unit,CFU)的变化;利用RNAi技术沉默Dorsal和Relish,qRT-PCR检测20E处理后AMPs的表达情况。结果如下:1.对6龄取食期(6th-12 h)和变态蜕皮期(6th-72 h)棉铃虫注射革兰氏阳性菌藤黄微球菌(Micrococcus luteus)与革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)后,发现棉铃虫在变态蜕皮期对这两种细菌的抵抗能力显著高于取食期。2.分别提取6龄取食期(6th-24 h)与变态蜕皮期(6th-72 h,6th-96 h)棉铃虫脂肪体总RNA,通过qRT-PCR检测了七个抗菌肽基因以及两个转录因子的表达水平,结果表明脂肪体中免疫相关基因的表达在变态蜕皮期显著升高,免疫应答增强。3.分别检测6龄取食期(6th-6 h,6th-24 h)和变态蜕皮期(6th-72 h,6th-96 h)棉铃虫血淋巴中的20E滴度,结果表明棉铃虫取食期到变态蜕皮期的20E滴度逐渐升高。4.对6龄取食期(6th-12 h)棉铃虫注射20E后分别感染M.luteus和P.aeruginosa,发现血淋巴中的CFU数目在M.luteus感染24 h与P.aeruginosa感染36 h后与对照组相比显著降低,表明20E增强了棉铃虫的抗菌能力。5.通过Western blot检测Dorsal和Relish的变化,结果表明Dorsal的表达在变态蜕皮期增高,Relish的切割活化也逐渐增强。为了进一步确定Dorsal表达增高以及Relish活化增强是否受20E调控,对6龄取食期(6th-6 h)棉铃虫进行外源20E注射,结果显示20E促进Dorsal和Relish的表达,证明Dorsal和Relish表达受20E调控。6.对6龄取食期(6th-6 h)棉铃虫进行20E处理,利用qRT-PCR检测了脂肪体中抗菌肽基因的表达水平,结果表明棉铃虫体内七个抗菌肽的表达在20E处理后显著升高;通过对Dorsal和Relish干扰进一步探究其在20E诱导抗菌肽表达中的作用,结果显示干扰Dorsal和Relish后抗菌肽表达受到抑制,表明Dorsal和Relish共同参与20E对棉铃虫抗菌肽的调控。综上所述,20E在棉铃虫免疫反应中起到促进作用。在棉铃虫发育过程中,20E滴度逐渐升高,并通过Dorsal和Relish共同调控脂肪体中抗菌肽的表达,增强棉铃虫的免疫应答能力以及抗菌能力,为即将进行的蜕皮和化蛹提供防御保障。
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