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脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)是生活在浅海低盐水域的底栖中小型虾类,以其环境适应性广、繁殖率高、生长速度快、食性杂等优点成为沿海滩涂地区的重要的水产养殖品种。随着规模化养殖的扩大,脊尾白虾显示出良好的养殖前景。然而随着养殖环境恶化、细菌和病毒等引起的疾病频繁爆发,对虾类养殖业造成了严重的经济损失,因此研究脊尾白虾的免疫防御机制是解决问题的关键,可以为疾病防治提供理论基础。脊尾白虾等无脊椎动物不具备获得性免疫,其体内不具有免疫球蛋白,只能够依靠细胞免疫和体液免疫等非特异免疫系统来防御及清除各种异物的入侵。血蓝蛋白是近年来在虾蟹类等甲壳动物中发现的具备多种非特异性免疫功能的免疫蛋白,但脊尾白虾血蓝蛋白大亚基及其变体全长序列及免疫学功能尚不清楚。鉴于此,本研究以脊尾白虾为研究对象,应用分子生物学、免疫学等方法对血蓝蛋白大亚基及其变体开展功能研究。1.脊尾白虾血蓝蛋白大亚基基因的克隆及表达分析采用RACE技术克隆了脊尾白虾血蓝蛋白大亚基基因cDNA全长序列,全长2192 bp,开放阅读框(ORF)2034 bp,其中5’非编码区21 bp,3’非编码区137 bp,将该基因命名为EcHcL。EcHcL基因由667个氨基酸编码,前21个氨基酸构成信号肽,推测成熟肽的分子量为78.5kDa。Blast比对结果显示,由脊尾白虾血蓝蛋白EcHcL序列推导的氨基酸序列与日本沼虾(Macrobrachium nipponense)、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)血蓝蛋白氨基酸序列的同源性分别达到87%、73%,其M结构域氨基酸序列与斑节对虾(Penaeus monodon)、日本对虾(Marsupenaeus japonicus)等物种同源性高达90%左右,由此推断该cDNA序列属于血蓝蛋白家族。组织表达分析显示,EcHcL基因在脊尾白虾鳃、卵巢、肝胰腺、心脏、肠、肌肉、胃、腹神经节、眼柄和血细胞中均有表达,肝胰腺中相对表达量最高。Real-time PCR分析发现EcHcL基因在金黄色葡萄球菌(Stphylococcus aureus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和对虾白斑综合征病毒(WSSV)感染后脊尾白虾肝胰腺和血细胞中的表达量显著增加。金黄色葡萄球菌感染后,肝胰腺和血细胞EcHcL分别在48h和24h达到最大值,约是对照组的2倍;副溶血弧菌感染后,肝胰腺EcHcL和血细胞EcHcL在12h和24h达到最大值,分别约为对照组的8倍和3倍;肝胰腺及血细胞EcHcL基因在WSSV感染后,分别在12h和24h达到最高值,分别约是对照组的4倍和2倍;注射dsEcHcL和感染病原后,结果显示随着注射时间的延长,EcHcL在肝胰腺和血细胞中表达量显著低于对照组。综上结果,揭示脊尾白虾血蓝蛋白具有抗菌抗病毒作用。2.脊尾白虾血蓝蛋白大亚基变体基因的克隆及表达分析基于脊尾白虾转录组文库大亚基变体EcHcL1、2、3序列,利用RACE和生物信息学技术,对3种变体进行全长cDNA扩增和序列分析。结果发现EcHcL1、2、3全长分别为2239 bp、2132bp、2188bp,编码685、676、676个氨基酸。EcHcL1-3在进化上相对保守,且与EcHcL相比均具有血蓝蛋白的典型结构域,包括铜离子结合区域,保守His位点和Ig-like区等,其中EcHcL1多了一个酪氨酸酶结构域,推测可能与色素代谢及酚氧化酶活性有关。组织表达分布结果显示EcHcL1-3在10种组织中均有表达,且均在肝胰腺和血细胞中表达较高。由此推测脊尾白虾血蓝蛋白大亚基的不同变体也可能具有不同的免疫学功能。采用Real-time PCR方法对病原感染后3种变体的mRNA表达情况进行分析。结果发现,EcHcL1在金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌和WSSV胁迫脊尾白虾12-48h中出现较高表达量,且为对照组的1.5-4倍;EcHcL2和EcHcL3在胁迫后24h-48h后,与对照组相比,表达量分别上升2-9倍和2.5-9倍。由此说明,脊尾白虾血蓝蛋白大亚基变体与免疫防御紧密相关,可能具有抗菌活性。3.脊尾白虾血蓝蛋白EcHcL3基因的原核表达及抑菌效果分析在上述研究基础上,进一步选取与病原感染免疫相关性最显著的EcHcL3进行原核表达及抑菌实验。构建了pET28a-EcHcL3原核表达载体,对pET28a-EcHcL3进行了诱导表达,原核表达结果显示成功诱导表达并纯化出rEcHcL3重组蛋白,分子量80kDa,与预期大小一致;质谱检测结果显示与原序列成功匹配。进一步对rEcHcL3进行抑菌实验,结果显示rEcHcL3对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有广泛的抑菌效果,且在浓度为0.01mg/mL的低浓度下,对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌(Escherichia coli)、副溶血弧菌、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)和鳗弧菌(Vibrio anguillarum)的生长抑制率分别为25.9%、24.8%、18.6%、41.5%和21.0%,表明其对细菌具有较强的抑制作用,为进一步研究血蓝蛋白的多种免疫学作用提供了实验证据。