耐药菌的广泛传播,严重威胁了人类和动物的健康。细菌中耐药基因的传播主要通过转化、转导、接合等方式,其中由耐药质粒介导的细菌接合转移是最易发生的传递方式,且不同来源的细菌可以通过质粒的介导而获得相同的耐药谱,造成抗生素在临床上的疗效降低甚至无效。耐药质粒介导的耐药与染色体突变导致的耐药不同,耐药质粒可以通过水平基因传递进行扩散,但是耐药质粒一旦被消除,其耐药性不可恢复,除非外源耐药质粒再次转入,因此,利用分子生物学技术手段消除耐药质粒或阻断其传递具有重要意义。Cfr(chloramphenicol-florfeniclolresistance)基因是一种多重耐药基因,大多由质粒携带,少数位于染色体上,该基因编码的Cfr蛋白为细菌核糖体23S rRNA甲基化酶,能同时介导氯霉素类、恶唑烷酮类、林可酰胺类、链阳菌素A类、截短侧耳素类等五类化学结构不同的抗菌药物耐药。目前,已在多个地区动物源和人源的多种细菌中检测到cfr基因,并有逐渐蔓延扩散的趋势。本研究应用CRISPR/Cas9技术,建立了高效特异清除大肠杆菌中多重耐药基因命的方法。首先,在大肠杆菌中验证了应用CRISPR/Cas9系统可以清除多拷贝的卡那霉素抗性的GFP报告质粒,通过对GFP报告菌中GFP荧光和抗生素抗性检测,证明该系统在大肠杆菌中可以有效清除多拷贝质粒。其次,构建了针对多重耐药基因决的打靶载体,并以大肠杆菌S17-1为供体菌,含有携带决基因的耐药质粒的大肠杆菌为受体菌,利用接合反应水平传递CRISPR/Cas9系统到受体细菌中,清除受体菌中的耐药质粒,其接合效率为0.22%。最后,通过同源重组构建了不依赖于宿主菌S17-1的可自我转移的打靶载体,通过接合反应成功打靶多重耐药基因cfr,清除了受体菌中的耐药质粒,接合效率为1.43%。综上所述,本实验建立的清除多重耐药质粒的方法不仅能有效地消除受体菌中的耐药质粒,恢复其对抗生素的敏感性,而且使受体菌获得了对靶耐药基因的免疫能力。因此该方法可以在机体/环境中安全有效的控制耐药基因,不会使细菌产生新的耐药性,该方法有望成为一种安全高效的清除机体/环境中有害细菌的工具。