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家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)为双链DNA病毒,其基因组共含有143个开放阅读框(Open reading frame,ORF),是家蚕的主要病原体。BmNPV泛素基因(ubiquitin)编码一个由77个氨基酸组成的小分子蛋白。杆状病毒是目前已知的仅有的含有泛素基因的病毒,而在真核生物中,泛素是一个广泛存在且十分重要的小分子蛋白,在细胞凋亡、蛋白的特异性降解、细胞分化等众多方面都有着十分重要的作用。目前对于杆状病毒泛素基因的研究尤其是BmNPV的泛素基因(vub)的研究还较少,本研究从生物信息学,转录时相,表达时相,基因的敲除、拯救与替换,49种杆状病毒与16种昆虫宿主泛素基因的差异与进化等方面对BmNPV泛素做了基础性的研究,为杆状病毒泛素基因的后续研究提供了研究基础,具体研究结果如下: (1)生物信息学分析显示,BmNPV泛素蛋白(VUB)由77个氨基酸残基组成,预测分子量约为8.65kDa,等电点为6.56。该蛋白并无信号肽区域,亚细胞定位预测表明该蛋白在宿主细胞的细胞质与细胞核当中均有分布。三维结构预测显示VUB为一个球状结构,包含了3个α-螺旋和5个β-折叠,该结构与所预测的家蚕泛素蛋白三维结构十分相似。 (2)通过原核表达系统对vub进行分子克隆并进行原核表达,大量诱导VUB的表达,并对目的蛋白进行纯化切割,成功制备多克隆抗体。验证所制备抗体的特异性与效价较高,可以满足后续实验的需要。 (3)转录时相与表达时相分析均表明vub为极晚期基因,但是该基因在BmN细胞中的转录时间比在家蚕中肠组织中的转录时间提前了约24小时。此外,表达时相分析表明,vub可能参与了家蚕细胞中的UPP途径。三种不同品系家蚕(NB、306、BC8)中肠组织中vub的表达出现了比较明显的差异,这暗示vub可能与家蚕抗病毒机制有一定的关系,具体机制有待进一步研究。 (4)构建重组Bacmid并转染BmN细胞,通过荧光报告蛋白EGFP观察病毒的转染增殖情况,并通过TCID50分析来确定vub的缺失是否像AcMNPV泛素基因缺失一样,导致BV的产量有大幅度下降。结果显示,不论何种重组Bacmid,转染细胞后所观察到的荧光现象基本一致,并未出现明显差异,说明vub的缺失并不会影响病毒基因组的复制。 (5)进化分析结果显示,泛素基因在昆虫宿主和杆状病毒中都受到了很强的纯化选择压力,且昆虫宿主泛素基因所受到的纯化选择压力要比杆状病毒泛素基因更大,即昆虫泛素进化更为保守。系统发育分析的结果显示,二者可能拥有古老的共同祖先。我们推测,杆状病毒的泛素基因同Chi和UGT蛋白一样,源自宿主的水平转移。