论文部分内容阅读
目的：本文用阳离子脂质二油酰磷脂酰胆碱(1，2-dioleov1-3-trimethylammonium-propane，DOTAP)和中性磷脂1，2-二油酰基卵磷(1，2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DOPC)制备成携带不同表面电荷的阳离子脂质体，作为疫苗载体和佐剂。阳离子脂质体定量后，体外实验考察其对人外周血单核细胞活化和细胞活性的影响、人树突状细胞(dendritic cells，DC)的成熟活化影响、RAW264.7细胞和小鼠腹腔巨噬细胞摄取的影响。体内实验研究阳离子脂质体包裹鸡卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)免疫C57小鼠，考察其对小鼠体内产生抗体滴度的影响。
方法：薄膜水化超声法制备阳离子脂质体，使用电位粒度仪、扫描电镜和透射电镜检测脂质体的表征以及用超滤法检测阳离子脂质体的包封率。用考马斯亮蓝定量法、藻红B定量法和硫氰铁胺定量法定量阳离子脂质体的量。体外实验：一系列带有不同表面电荷的DOTAP/DOPC阳离子脂质体与人外周血单核细胞共育24 h，然后采用流式细胞术和酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbentmethod，ELISA)等手段分别检测单核细胞CD14和CD86的表达、细胞活性、培养上清中TNF-α的水平。DOTAP/DOPC阳离子脂质体与树突状细胞共育24 h，然后采用流式细胞术检测DC表面分子CD86和CD83的表达量。RAW264.7细胞和小鼠腹腔巨噬细胞与包裹FITC-BSA的阳离子脂质体孵育30 min后，流式细胞仪和荧光显微镜观察细胞摄取阳离子脂质体的量。小鼠体内实验：6-8周的C57小鼠分别每隔两周腹腔免疫一次包裹OVA的阳离子脂质体，然后分别在免疫的第10天和第21天眼球内眦采血，ELISA法检测血清中的IgG，IgG1和IgG2a的抗体滴度。
结果：空白阳离子脂质体的粒径200 nm左右，而且粒径分布比较均一，包裹OVA的脂质体粒径在300-600 nm之间。随着DOPC的掺入的增加阳离子脂质体表面的电荷成下降趋势。阳离子脂质体的蛋白包封率接近100％，而中性脂质体DOPC的包封率在90％左右。并且阳离子脂质体在制备过程中，几乎没有损失。体外实验结果显示：阳离子脂质体DOTAP/DOPC(5:0、4:1、3:2、2:3)诱导单核细胞活化，促进细胞表达共刺激分子CD86和分泌细胞因子TNF-α。阳离子脂质体DOTAP/DOPC(5:0、4:1、3:2、2:3)诱导人树突状细胞的成熟，促进细胞表达共刺激分子CD83和CD86。阳离子脂质体活化单核细胞和人DC的能力直接依赖于其表面电荷的强度，表面电荷过高或过低均可削弱阳离子脂质体的免疫调节作用。此外，阳离子脂质体对单核细胞的细胞毒性作用也具有电荷依赖性，降低脂质体的表面电荷可显著降低其细胞毒性。Raw细胞和小鼠腹腔巨噬细胞对阳离子脂质体的摄取同样依赖于其表面的电荷，脂质体表面电荷越高其细胞摄取率越高。体内实验：d10天的小鼠血清中IgG含量：铝佐剂组和阳离子脂质体DOTAP/DOPC(5:0和4:1)组与OVA对照组相比差异具有统计学意义。d10天的小鼠血清中IgG1含量：铝佐剂组与OVA对照组相比差异具有统计学意义，阳离子脂质体DOTAP/DOPC(5:0和4:1)与OVA对照组相比虽无统计学意义，但是滴度却高于OVA对照组。d10天的小鼠血清中IgG2a含量：OVA对照组和铝佐剂组的抗体滴度为0，而阳离子脂质体DOTAP/DOPC(5:0)组抗体滴度(48.97)和阳离子脂质体DOTAP/DOPC(4:1)组抗体滴度(23.93)。d21天的小鼠血清中IgG含量：阳离子脂质体DOTAP/DOPC(5:0)与OVA对照组相比差异具有统计学意义。d21天的小鼠血清中IgG1含量：与OVA对照组相比各组差异均无统计学意义。d21天的小鼠血清中IgG2a含量，而阳离子脂质体DOTAP/DOPC(5:0、4:1、3:2、2:3)与OVA对照组相比差异均具有统计学意义。可得出阳离子脂质体的诱导小鼠体内的IgG、IgG1和IgG2a抗体滴度同样依赖于其表面电荷，表面电荷越高抗体滴度越高。其中阳离子脂质体诱导小鼠产生IgG2a抗体的滴度远远高于铝佐剂。
结论：调整阳离子脂质体的表面电荷对于增强脂质体的免疫促进作用并减轻其副反应具有重要意义。