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实验目的:流感是流感病毒引起的急性呼吸道传染病,好发于冬、春季节。尤其是甲型流感病毒,由于其极易产生变异,制备有效的疫苗困难重重,而针对流感病毒感染的西药既有较强的毒副作用,又容易诱导病毒产生耐药性。这种现状下,在我国的中医药宝库中寻找有效药物、创造新型药剂来防治流感就成为一项很有意义的研究工作。毒热平注射液是由黄芩、栀子、灯盏花、猪胆粉等四味药物组成的中药复方制剂,根据中医理论“毒损肺络”病机理论配伍研制而成,具有清热燥湿、凉血解毒、活血通络的功效。本实验采用流感病毒亚甲型鼠肺适应株（FM1）感染小鼠作为模型,观察毒热平注射液对FM1不同时相感染小鼠的抗病毒作用及其对免疫功能的影响,以天然免疫中重要的模式识别受体Toll样受体为切入点,探讨其抗病毒作用及免疫调节作用的分子机制,为毒热平注射液的临床应用提供理论依据。实验方法:1.毒热平注射液对FM1感染小鼠死亡保护率的影响将ICR小鼠随机分为七组:正常组、模型组、利巴韦林组、双黄连组、毒热平注射液大、中、小剂量组,以4LD50的流感病毒液滴鼻感染小鼠造模,0.05mL/只,正常组以生理盐水滴鼻对照。造模后当日腹腔注射给药,每天1次,连续7天;正常组和模型组小鼠注射生理盐水对照。自造模当日起连续观察14天,计算各组死亡率及平均生活日。2.毒热平注射液对FM1不同时相感染小鼠肺损伤及病毒增殖的影响将ICR小鼠随机分为七组:正常组、模型组、利巴韦林组、痰热清组、毒热平注射液大、中、小剂量组,以4LD50的流感病毒液滴鼻感染小鼠造模,0.05mL/只,正常组以生理盐水滴鼻对照。造模后当日腹腔注射给药,每天1次;正常组和模型组小鼠注射生理盐水对照。按照要求在不同时间点处死小鼠,摘取肺脏,计算肺指数,同时各组取肺组织分别进行固定和匀浆,作病理形态学检测和肺组织中病毒滴度的检测。3.毒热平注射液对FM1不同时相感染小鼠免疫功能的影响动物分组、造模、给药方法同上。按照要求在不同时间点处死小鼠,无菌取脾脏做脾脏T、B淋巴细胞增殖活性的检测,采用MTT法;摘取小鼠肺脏进行匀浆,和小鼠血清一起用ELISA试剂盒检测炎症因子TNF-α、IFN-β、IFN-γ、IL-4、IL-12以及趋化因子IL-8、MIP-2、RANTES、IP-10等的含量。4.毒热平注射液对FM1病毒感染小鼠免疫调控分子机制的研究动物分组、造模、给药方法同上。按照要求在不同时间点处死小鼠,冰浴条件下无菌迅速摘取小鼠肺脏,置于无RNase EP管中,立即投入液氮中冷冻。每组取5个肺组织。用PCR法检测肺组织中TLR3及PKR mRNA的表达,用Western-blot法检测TLR3及PKR蛋白的表达。实验结果:1.毒热平注射液对FM1感染小鼠死亡保护率的影响模型组的死亡率为75%,平均生存时间为8.69d。毒热平注射液中剂量组死亡率为36.3%,与模型组比较,经x2检验差异显著,P＜0.05;毒热平注射液大剂量组平均生存时间为10.8d,与模型组比较P＜0.05;毒热平中剂量组平均生存时间为11.81d,与模型组比较P＜0.01。2.毒热平注射液对FM1不同时相感染小鼠肺损伤及病毒增殖的影响2.1在不同时间点观察受试动物,可见正常组小鼠体重稳步上升,模型组小鼠的体重在三个时间点表现出先增加再下降的趋势,且均显著低于正常组。用药组中,利巴韦林组体重逐渐增加,痰热清组及毒热平各剂量组趋势同模型组。在每个时间点上,造模72h后,与模型组比较,发现毒热平中剂量组有明显差异,P＜0.05;造模120h后,毒热平小、中剂量组与模型组比较有明显差异,P＜0.05或P＜0.01。2.2在不同时间点观察受试动物,可见模型组及各用药组的肺指数均呈现逐步升高的趋势。在每个时间点上,造模72h后,与模型组比较,利巴韦林组肺指数有显著性差异,P＜0.01;毒热平中、大剂量组有明显差异,P＜0.05;造模120h后,与模型组比较,发现利巴韦林组肺指数有极为显著性差异,P＜0.001;毒热平中剂量组有明显差异,P＜0.05。2.3在不同时间点观察受试动物,可见模型组及各用药组肺组织中病毒滴度呈现逐步上升的趋势。感染120h后,与模型组相比,利巴韦林对肺脏中的病毒杀伤效果最明显,P＜0.001;毒热平注射液中剂量组对肺脏中的病毒亦有明显杀伤作用,P＜0.01,其余用药组与模型组比较无差异。2.4 HE染色光镜观察正常组小鼠肺泡结构完整清晰,腔内未见渗出。模型组造模24h可见弥漫性肺泡壁增厚,肺泡壁血管扩张充血,有少量单个核细胞浸润,部分肺泡有少量出血。造模72h后可见弥漫性肺泡壁增厚,部分区域较前次显著增厚,有明显单个核细胞浸润。造模120h后可见支气管管腔内有出血及炎性渗出,支气管周围有多量淋巴细胞浸润;弥漫性肺泡壁增厚,局灶性肺泡实变。各用药组病变明显减轻,但随时间变化而病变均逐渐加重。利巴韦林120h组仍只见轻度病变;痰热清组、毒热平大、中、小剂量组病变均呈进行性加重,但均轻于同时期模型组。3.毒热平注射液对FM1不同时相感染小鼠免疫功能的影响3.1不同时间点观察受试动物,可见模型组脾脏T、B淋巴细胞增殖活性随时间变化呈现逐渐下降的趋势,造模后小鼠的T细胞增殖活性比B细胞增殖活性抑制更为明显。在三个时间点,模型组T细胞的增殖活性均明显受抑,P＜0.001,各用药组对其均有不同程度的恢复;造模24h后可见除利巴韦林组外的各中药组还表现出免疫促进的作用,与正常组相比显著增高,P＜0.001。造模72h后和120h,各用药组对小鼠的免疫抑制也有了不同程度的恢复,与模型组相比P＜0.001～P＜0.05,但均未恢复到正常组水平。各组B细胞增殖活性变化与T细胞近似,但变化程度较为缓和。3.2不同时间点检测各组动物血清及肺匀浆中的细胞因子,可见模型组除IL-4水平随时间变化逐渐降低外,TNF-α、IFN-β、IFN-γ、IL-12以及趋化因子IL-8、MIP-2、RANTES、IP-10均呈现逐渐升高的趋势。各用药组对其有不同程度的干预作用。总体来说,相比而言,对各细胞因子的干预效果,痰热清组＞利巴韦林组＞毒热平大剂量组＞毒热平中剂量组,毒热平小剂量组一般来说效果较差。4.毒热平注射液对FM1病毒感染小鼠免疫调控分子机制的研究与正常组相比,模型组小鼠不同时相感染FM1后对肺组织中TLR3及PKR mRNA及蛋白的表达水平造成了不同程度的增高,药物亦发挥了不同程度的干预作用。总体而言,TLR3及PKR mRNA及蛋白的表达水平随时间变化呈现先升高（72h）、后下降（120h）的趋势,除毒热平小剂量组外,其他各用药组均可抑制其升高的水平,与模型组相比,P＜0.01或P＜0.05,但均不能恢复到正常组水平。结论1.毒热平注射液具有抗病毒作用通过观察药物对肺脏中病毒滴度的影响发现,毒热平注射液中剂量组可明显抑制肺脏中病毒的增殖,具有一定的抗病毒作用。2.毒热平注射液对FM1感染小鼠的死亡和肺组织损伤具有保护和改善作用:毒热平注射液中剂量组可明显降低FM1感染小鼠的死亡率,降低肺指数,改善肺脏病理变化,对FM1感染小鼠的死亡和病毒引起的肺组织损伤具有保护作用。3.毒热平注射液对FM1感染小鼠免疫功能具有调节作用:3.1流感病毒FM1感染小鼠后,对脾脏T、B淋巴细胞的增殖活性具有明显的抑制作用,而毒热平注射液可对其有明显的恢复作用。3.2毒热平注射液对FM1感染小鼠血清及肺组织匀浆中细胞因子水平具有调节作用,可显著升高因病毒感染引起的IL-4下调以及抑制其他细胞因子和趋化因子的上调,减轻炎性病理损伤,进而恢复机体免疫功能的稳定和平衡,并帮助机体抵御病毒的侵害作用。4.毒热平注射液可通过调节肺组织中TLR3和PKR的表达水平来发挥免疫调节作用。