研究背景和目的:乳腺癌（Breast cancer,BC）是世界范围内最常见的癌症之一,是女性癌症患者死亡的主要原因。近年来我国早期乳腺癌5年生存率达到了83%左右,但转移性乳腺癌患者的5年生存率仍然很低。因此研究乳腺癌转移的分子机制有助于制定乳腺癌的治疗策略。环指蛋白6(（Ring finger protein 6,RNF6）是E3泛素连接酶家族的一个成员,调控着许多对细胞生长和存活非常重要的靶基因。最近的研究表明,RNF6可以通过泛素蛋白酶体促进靶蛋白的降解。而且有研究报道RNF6是多种癌症的致癌基因,包括前列腺癌、食管鳞状细胞癌和肺腺癌。例如:结直肠癌中RNF6的表达水平升高,高RNF6水平与预后不良相关。但是RNF6在乳腺癌侵袭转移中的作用及其可能机制尚待阐明。Hippo信号是一种进化上保守的信号通路,在控制肿瘤细胞的侵袭和迁移方面起着关键作用。Hippo途径的核心是一个激酶级联反应,激活哺乳动物STE20样蛋白激酶（MST）1/2磷酸化,激活肿瘤抑制激酶1/2,磷酸化和抑制Hippo途径的两个主要下游效应器相关蛋白（YAP）和具有PDZ结合的转录辅激活剂模体（TAZ）。去磷酸化的YAP和TAZ进入细胞核,诱导靶基因表达,促进细胞迁移。研究表明YAP在某些肿瘤中过度表达,YAP的持续表达促进了肿瘤的生长和发生,提示Hippo途径在肿瘤发生中起关键作用,然而YAP在乳腺癌中的表达调控机制尚不清楚。在本研究中,我们首先发现乳腺癌组织中RNF6的表达明显高于癌旁正常组织。然后我们研究了RNF6在乳腺癌细胞中的表达和功能。我们还发现RNF6可能是MST1的E3连接酶,而且它与MST1相互作用并促进其降解。这些数据可能突出了RNF6在乳腺癌中的作用,它可能作为乳腺癌患者有价值的预后指标和潜在的治疗靶点。方法:1、通过qRT-PCR、Western blot和免疫组化的实验方法检测146例乳腺癌组织及配对癌旁组织中RNF6基因的m RNA和蛋白的表达情况,并分析RNF6基因的表达与患者临床病理特征的关联及其对临床预后的影响。2、利用qRT-PCR和Western blot实验检测人正常乳腺MCF10A细胞和4株乳腺癌细胞系（BT549,MCF7,MDA-MB-453和MDA-MB-231）中RNF6基因的m RNA和蛋白的表达情况;选取内源性RNF6基因高表达的乳腺癌MDA-MB-231和MDA-MB-453细胞株分别转染RNF6 sh RNA干扰质粒下调这两株细胞中RNF6表达,并通过qRT-PCR和Western blot检测干扰效果;通过Transwell细胞侵袭迁移实验和裸鼠肺转移实验检测改变RNF6蛋白表达后对乳腺癌MDA-MB-231和MDA-MB-453细胞的侵袭和迁移能力的影响。3、采用荧光素酶报告基因和Western blot实验检测下调乳腺癌细胞中RNF6的表达后对YAP及其下游靶基因的蛋白表达和外源性导入及内源性表达的YAP基因转录活性的影响;此外,在乳腺癌细胞中下调RNF6表达的同时激活Hippo-YAP通路以及在上调RNF6表达的同时抑制Hippo-YAP通路,通过Western blot实验测定RNF6和YAP的蛋白表达水平,并通过进行Transwell实验和裸鼠肺转移实验模型分析乳腺癌细胞侵袭和迁移能力的变化。4、在乳腺癌MDA-MB-231和BT549细胞中分别转染MST1 sh RNA干扰质粒和p-MST1过表达质粒改变MST1的表达后通过Western blot实验检测MST1和YAP蛋白表达的变化;同样在上述乳腺癌MDA-MB-231和BT549细胞中分别转染RNF6 sh RNA干扰质粒和p-RNF6过表达质粒改变RNF6表达后通过Western blot实验测定RNF6、MST1和YAP的蛋白表达变化;另外,在乳腺癌MDA-MB-231细胞中同时下调RNF6和MST1的表达后通过Western blot实验测定RNF6、MST1和YAP的蛋白表达变化,并通过进行Transwell实验和裸鼠肺转移实验模型分析乳腺癌细胞侵袭和迁移能力的变化。5、采用细胞免疫荧光和免疫共沉淀实验检测乳腺癌细胞中RNF6蛋白和MST1蛋白是否存在直接相互结合;在乳腺癌中下调及上调RNF6的同时加入蛋白酶体抑制剂MG132阻断蛋白降解后,利用Western blot检测RNF6和MST1蛋白表达变化;在乳腺癌中下调RNF6的同时加入放线菌酮（CHX）阻断蛋白合成后,检测MST1蛋白降解速率的变化;利用免疫共沉淀实验观察下调RNF6后对MST1的泛素化水平的影响。结果:1、qRT-PCR实验结果显示在乳腺癌组织中RNF6基因的m RNA表达较配对癌旁组织明显增加（P＜0.01）;Western blot实验结果发现在乳腺癌组织中RNF6蛋白较配对癌旁组织呈高表达（P＜0.01）;免疫组化实验结果发现RNF6蛋白在65.75%（96/146）的乳腺癌组织中呈明显高表达,而配对癌旁组织中仅有少数呈高表达（P＜0.01）。RNF6基因的表达与患者临床病理特征统计学分析显示乳腺癌组织中RNF6高表达与患者TNM分期（P＜0.001）以及淋巴结转移（P=0.004）密切相关。Kaplan–Meier法分析结果表明与RNF6表达水平较低的患者相比,RNF6水平较高的患者总体生存率和无病生存率较低（P＜0.05）。此外,多变量Cox回归分析的结果表明RNF6表达水平高是乳腺癌患者存活率低的独立预测因子（P＜0.05）。2、乳腺癌细胞中RNF6的m RNA和蛋白表达均明显高于人正常乳腺细胞（P＜0.05）;在乳腺癌MDA-MB-231和MDA-MB-453细胞分别转染RNF6 sh RNA干扰质粒后qRT-PCR和Western blot检测表明RNF6的m RNA和蛋白表达均明显下调（P＜0.05）;且Transwell实验发现乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力受到明显抑制（P＜0.01）。另外,裸鼠体内肺转移实验进一步发现下调乳腺癌MDA-MB-231和MDA-MB-453细胞中RNF6基因的表达后可以减少裸鼠乳腺癌远处肺转移（P＜0.05）。3、在乳腺癌细胞中下调RNF6基因的表达后发现YAP的蛋白表达、YAP的转录活性和其下游靶基因Cyr61、CTGF和cyclin E蛋白表达均明显受到抑制。在乳腺癌细胞中下调RNF6表达的同时激活Hippo-YAP通路后Western blot实验结果发现可以明显恢复YAP的蛋白表达,且Transwell实验结果表明乳腺癌细胞的侵袭和迁移能力得到恢复,同时裸鼠乳腺癌远处肺转移较下调RNF6基因的表达组明显增多（P＜0.01）;另外,在乳腺癌细胞中上调RNF6表达的同时抑制Hippo-YAP通路后Western blot实验结果发现可以明显抑制YAP的蛋白表达,且Transwell实验结果表明乳腺癌细胞的侵袭和迁移能力受到显著抑制,同时裸鼠乳腺癌远处肺转移较上调RNF6基因的表达组明显减少（P＜0.01）。4、在乳腺癌MDA-MB-231和BT549细胞中分别下调和上调MST1蛋白的表达后Western blot实验结果发现YAP蛋白表达也分别出现增加和减少,同样在上述乳腺癌MDA-MB-231和BT549细胞中分别下调和上调RNF6蛋白表达后Western blot实验表明YAP的蛋白表达也分别出现减少和增加,而MST1的蛋白表达则分别出现增加和减少;此外,在乳腺癌细胞中同时下调RNF6和MST1的表达后Western blot实验表明YAP蛋白表达明显增加,且Transwell实验显示乳腺癌细胞侵袭和迁移能力得到恢复,裸鼠乳腺癌远处肺转移明显增多（P＜0.01）。5、细胞免疫荧光和免疫共沉淀实验发现在乳腺癌MDA-MB-231细胞中RNF6和MST1存在直接结合,且在用蛋白酶体抑制剂MG132处理乳腺癌细胞后,内源性MST1蛋白表达量逐渐累积,说明在乳腺癌细胞中MST1蛋白经过泛素蛋白酶体系统降解。在加入放线菌酮（CHX）阻断蛋白合成的情况下,在乳腺癌MDA-MB-231细胞下调RNF6的表达,再通过Western blot实验检测MST1的蛋白表达变化,结果显示sh RNF6组细胞表达的MST1的降解速率明显降低。另外我们还在乳腺癌MDA-MB-231细胞分别下调或上调RNF6蛋白表达后,同时用蛋白酶体抑制剂MG-132处理,再通过Western blot实验检测MST1的蛋白表达变化,结果显示MST1蛋白表达无明显变化,说明RNF6参与了MST1蛋白的降解过程。最后,我们降低乳腺癌细胞中RNF6的表达后发现MST1蛋白的泛素化水平显著降低,说明RNF6通过影响MST1的泛素化水平而影响MST1蛋白的表达。结论:综上所述,RNF6在乳腺癌组织中呈显著高表达,且与肿瘤分期、淋巴结转移等临床病理特征及患者的不良预后密切相关,揭示了RNF6通过介导MST1/YAP轴调控乳腺癌的侵袭和转移的具体机制,为乳腺癌治疗的预后指标和治疗靶点提供了科学理论基础。