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第一部分直肠神经内分泌肿瘤的临床病理特征描述目的:神经内分泌肿瘤（neuroendocrine neoplasm,NEN）根据分化程度不同,生物学行为存在很大差异。本研究通过描述单中心直肠NEN临床病理特征及预后情况,旨在指导直肠NEN的临床诊治及病情评估。方法:本研究收集了2007年7月至2019年7月于河北医科大学第四医院病理诊断为胃肠胰神经内分泌肿瘤（gastroenteropancreatic neuroendocrine neoplasm,GEP-NEN）患者401例,并对其中62例直肠NEN患者临床病例资料进行详细描述。分析患者的临床表现、全血细胞检查、内镜表现、组织病理学特征和预后等。结果:1.直肠NEN检出例数逐年增高本研究共收集了401例2007年7月至2019年7月于河北医科大学第四医院病理诊断为GEP-NEN患者。其中胃NEN 208例,小肠NEN 23例,胰腺NEN 99例,结肠NEN 9例,直肠NEN 62例。GEP-NEN发病率呈逐年升高趋势。胃NEN最多见,其次是胰腺NEN和直肠NEN,小肠和结肠NEN少见。2.直肠NEN临床病例特征直肠NEN共62例,男性40例,男性明显多于女性。平均年龄54.5±12.0岁。肿瘤距肛缘距离≤5cm患者31例,肿瘤距肛缘距离＞5cm患者28例。主要临床表现腹部疼痛（18/62,29.0%）及排便习惯改变（15/62,24.2%）。镜下表现多为隆起型新生物（51/62,82.3%）。6例患者在确诊时发现远处转移,远处转移部位分别是肝脏（5例）和骨转移（1例）。2例患者在术后随访过程中发生远处转移。21例发生淋巴结转移,40例无淋巴结转移,1例患者淋巴结转移信息未收集到。58例患者详细记录了肿瘤大小,肿瘤大小≤1cm的41例,1-2cm 10例,＞2cm 7例。术后病理:直肠NETG1 44例,NETG2 10例,NEC 6例,Mi NEN 2例。T分期:T136例,T2 9例,T3 7例,T4 10例。5例患者死亡,3例患者失访。中位生存时间未达到。1年、3年生存率分别为94.1%和82.6%。3.治疗前NLR、PLR及MLR值在不同临床病例特征间比较直肠NEN患者中,治疗前中性粒细胞与淋巴细胞比率（neutrophil-to-lymphocyte ratio,NLR）平均值为2.7±2.3,血小板与淋巴细胞比率（platelet-to-lymphocyte ratio,PLR）平均值为154.0±60.0,单核细胞与淋巴细胞比率（Monocyte-to-lymphocyte ratio,MLR）平均值为0.26±0.20。肿瘤病理分级（P＜0.001）、肿瘤T分期（P=0.001）、肿瘤大小（P=0.026）以及是否存在淋巴结转移（P＜0.001）组别间NLR差异有统计学意义,NEC及Mi NEN、T2+T3+T4、＞1cm以及淋巴结转移阳性的患者NLR均值较高。年龄（P=0.003）组别间PLR差异有统计学意义,≤55y患者PLR均值较高。肿瘤病理分级（P＜0.001）、T分期（P＜0.001）、肿瘤大小（P=0.017）以及是否存在淋巴结转移（P＜0.001）组别间MLR差异有统计学意义,NEC及Mi NEN、T2+T3+T4、＞1cm以及淋巴结转移阳性的患者MLR均值较高。并且死亡患者中NLR值明显高于生存患者（5.15 vs 2.60,P=0.002）。小结:随着结直肠癌筛查项目的不断发展,直肠NEN的发病率正在增加。肿瘤多数小于1cm,大部分直肠NEN为G1级NET,首选内镜下切除,但小于1cm的直肠NEN也会出现淋巴结转移,治疗前要准确评估分期。NEC及Mi NEN、肿瘤T分期较晚、肿瘤较大以及合并淋巴结转移患者NLR及MLR值较高,并且NLR可能是直肠NEN患者的预后因素。第二部分直肠神经内分泌肿瘤的淋巴结转移风险评分及预后分析目的:探索影响直肠NEN转移风险及预后的因素。明确肿瘤距肛缘的距离是否影响患者的预后。方法:收集了2007年7月至2019年7月于河北医科大学第四医院病理诊断为直肠NEN的患者62例。结果:1.症状在所有直肠NEN患者中,主要临床表现为便血（17.7%）、腹部疼痛或不适（33.9%）、排便习惯改变（24.2%）,15例（24.2%）患者无临床症状。2.影像特征在62例直肠NEN病例中,有47例（75.8%）内镜表现为粘膜下肿块,5例（8.1%）为息肉样肿块,8例（12.9%）表现为溃疡性肿瘤,2例（3.2%）为结节样表现。腹部增强CT检查发现27例表现为肠壁增厚,发现肝转移5例,骨转移1例。3.直肠NEN淋巴结转移风险评估62例直肠NEN患者,40例患者无淋巴结转移,21例患者存在淋巴结转移,1例患者不详。肿瘤大小（P＜0.001）,肿瘤T分期（P＜0.001）和肿瘤病理分级（P＜0.001）均与淋巴结转移有关。肿瘤直径＞2cm,T分期为T3和T4,肿瘤病理分级为NEC及Mi NEN的患者更容易发生淋巴结转移。肿瘤T分期（P=0.034）和肿瘤病理分级（P=0.001）是淋巴结转移的独立危险因素。进一步对直肠NEN患者制定了淋巴转移转移风险评分,结果显示得分≥7.5分的患者更有可能发生淋巴结转移（曲线下面积:0.958,95%CI 0.903-1.000,P＜0.001）。敏感性和特异性分别为72.2%和97.3%。4.与远处转移相关的危险因素单因素分析显示肿瘤病理分级（P=0.002）,T分期（P＜0.001）和淋巴结转移（P＜0.001）是影响直肠NEN远处转移的因素。并且多因素分析显示肿瘤病理分级（P=0.016）、T分期（P＜0.001）及淋巴结转移（P=0.001）是直肠NEN远处转移的独立影响因素。5.直肠NEN的生存分析62例直肠NEN患者中,54例生存,5例死亡,3例失访,随访率为95.2%。直肠NEC/Mi NEN患者的中位生存时间为26.0个月,NETG1和NETG2患者中位生存期未达到。随访时间不足6个月的患者0例,6个月至1年的患者有8例,超过1年的患者51例,超过3年的患者23例,超过5年的患者6例。在随访时间超过1年的51例患者中,直肠NETG1和NETG2患者1年生存率为97.7%,直肠NEC/Mi NEN患者1年生存率为75.0%。在随访时间超过3年的23例患者中,直肠NETG1和NETG2患者3年生存率为94.4%,直肠NEC/Mi NEN患者3年生存率为40.0%。在随访时间超过5年的6例患者中,2例分化差的直肠NEN（NEC/Mi NEN）死亡,4例分化好的直肠NET（NETG1和NETG2）仍生存。肿瘤T分期（P=0.001）、淋巴结转移（P=0.012）、肿瘤病理分级（P＜0.001）及肿瘤距肛缘距离（P=0.022）均与患者预后相关。分化良好（NETG1和NETG2）、肿瘤T分期为T1和T2、无淋巴结转移及肿瘤距肛缘距离＞5cm的患者预后较好。COX回归多因素分析发现肿瘤病理分级（P=0.004）及肿瘤距肛缘距离（P=0.012）是直肠NEN患者预后的独立影响因素。小结:肿瘤直径＞2cm,T分期为T3和T4,肿瘤病理分级为NEC及Mi NEN的患者更容易发生淋巴结转移。肿瘤T分期和病理分级是淋巴结转移的独立危险因素。分化良好（NETG1和NETG2）、T1和T2且无转移的直肠NEN患者具有较好的预后。肿瘤距肛缘距离＜5cm和淋巴结转移风险评分≥7.5分的患者应该给予密切随访和积极治疗。第三部分直肠神经内分泌肿瘤预后相关的分子特征及分子分型目的:直肠NEN基因组谱的研究相对较少。不同临床病理学特征的基因组改变相关研究甚至更少见。我们通过对直肠NEN患者的肿瘤样本进行全基因二代测序（Next-Generation Sequencing,NGS）,分析突变特征,旨在明确直肠NEN驱动基因、识别转移及不同病理分级直肠NEN突变基因及信号通路,进行分子分型,明确与临床预后相关的生物标记物,寻找潜在治疗靶点。方法:1.回顾性分析了2007年至2019年在河北医科大学第四医院治疗的62例直肠NEN患者的病例资料。总共62例肿瘤样本,38例样本进行了全基因NGS,24例肿瘤样本由于肿瘤组织较少,未能完成全基因组测序。根据两位病理学家的独立病理学评估,评估每个样本的Ki-67指数和分化情况（NET/NEC）。2.采用卡方检验分析转移/非转移性疾病与临床病理特征的关系。Fisher检验用于分析突变基因与临床特征之间的关系。基因突变谱由R语言绘制。使用非负矩阵分析（NMF 0.22版）进行突变谱和突变特征分析。使用KEGG数据库分析来评估信号通路富集。两侧P＜0.05被认为是显著。所有分析均在R4.1.2中进行。结果:1.直肠NEN的区域淋巴结转移和/或远处转移与肿瘤大小（P＜0.001）、肿瘤T分期（P＜0.001）和病理分级（P＜0.001）有关。2.38例标本进行全基因NGS,其中NETG1 30例,NETG2 3例,NEC3例,Mi NEN 2例。直肠NEN最常见突变基因是MUC16（21,55.3%）、OBSCN（15,39.5%）、FAT1（14,36.8%）、ZFHX3（14,36.8%）、AR（11,28.9%）和LRP2（11,28.9%）。不同类型直肠NEN存在差异突变基因。分析结果显示APC、TP53、FPR1、FAT4、NOTCH2、BRCA1、FBXW7、NF1、SOX9、ANGPT2、KEL、NOTCH3、PDGFB和RPTOR基因突变在直肠NEC及Mi NEN中突变频率高于直肠NETG1/G2。FANCD2（5例）、RUNX1（5例）、TET3（5例）、DAXX（6例）、LTK（6例）、MERTK（6例）、PKN1（7例）、FAT3（9例）及LRP2（11例）基因突变虽然在不同类型直肠NEN中无统计学差异,但这些基因突变仅见于G1及G2级直肠NET。KMT2C突变在直肠NET中更为常见。BCL2L1、DAXX、LTK突变仅发生在直肠NETG1中。SPEN仅发生在直肠NETG2中。TP53、TYK2、APC和PDGFB基因突变常见于转移性直肠NEN中。具有上述突变基因的患者具有高度转移风险。3.观察到癌基因CALR（9例）、DAXX（5例）、BCL（5例）、APEX1（3例）和NFKBIA（3例）的扩增,抑癌基因CDKN2A、CDKN2B和MTAP的缺失。基因的扩增和缺失与各临床病理特征之间无明显差异。4.检测了38例患者的TMB,中位TMB为9.87（1.1-61.8）Mut/Mb,显著低于TCGA数据库中常见肿瘤的中位TMB。年龄＞55岁（P=0.046）、NEC和Mi NEN（P=0.040）组中观察到高TMB。G1和G2级的NET的中位TMB水平显著低于NEC和Mi NEN。年龄大的、NEC及Mi NEN患者可能会从免疫治疗中获益。5.错配修复（P=0.030）、Wnt（P=0.029）、MAPK（P=0.016）、Hedgehog（P=0.037）和PI3K/AKT（P=0.037）信号通路参与了直肠NEN的转移。Wnt、MAPK和PI3K/AKT信号通路的改变促进了直肠NEN的转移。而错配修复及Hedgehog信号通路改变与直肠NEN转移呈负相关。P53（P=0.009）、Wnt（P=0.046）和TGFβ（P=0.019）信号通路改变在直肠NEC及Mi NEN更显著,这些信号通路的改变与分化差的NEN相关。6.C＞T和T＞C转换是直肠NEN中最主要的碱基替代形式。通过NMF提取突变特征,将突变特征分为8种类型,特征3和特征8显著表现为C＞T/T＞C碱基替换,并且与COSMIC数据库中的SBS6和SBS1描述的特征高度相似（相似性分别为0.89和0.815）。特征2、3与DNA错配修复缺陷（SBS6）相关,特征6、8与5-甲基胞嘧啶自发或酶促脱氨基（SBS1）相关,特征1、4和7可能与吸烟（SBS5）相关,特征5与暴露于紫外线（SBS7a）相关。通过分析每个样本中突变特征所占的比例,发现直肠NETG1主要致病原因是DNA碱基修饰及错配修复缺陷。直肠NETG2、NEC及Mi NEN以特征1、2、4、5、6、7混合的其他特征占主要特征,是由包含DNA错配修复缺陷、DNA碱基修饰、吸烟、暴露于紫外线等多种原因引起。7.38例患者中,81.6%的患者存在DNA损伤修复（DNA damage repair,DDR）基因。最显著的突变基因是KMT2C、MSH6、TP53和FANCI。含有DDR突变基因患者的TMB趋势更高（P=0.029）。表明含有DDR突变的直肠NEN患者可能会从PARP抑制剂及免疫治疗中获益。8.进一步通过突变基因及信号通路改变结合临床病理特征进行聚类分析,将直肠NEN分成三种类型。A型中19例患者,TP53、FANCA、NOTCH1、PLCG2、APC、PRKDC基因突变多见,涉及信号通路为Wnt、Notch、Cell.cycle、PI3K-AKT,多为NETG2和NEC,肿瘤T分期各分期都可见,8例患者发生了局部/远处转移。B型中10例患者,APEX1、DAXX、MSH6、SPTA1、CDH1、PKN1基因突变多见,涉及信号通路为Apoptosis、Wnt、Notch,NETG2和NEC各有1例,其余均为NETG1,1例患者肿瘤T分期为T3,其余均为T1,2例患者发生了局部/远处转移。C型中9例患者,可见LRP2基因突变多见,同时也可见MSH6突变,涉及信号通路为PI3K-AKT,所有患者均为NETG1,仅1例患者T分期为T2,并且仅1例患者发生局部/远处转移。C型患者在组织分化、肿瘤浸润及转移方面均优于A型和B型。LRP2基因突变多见于分化好的直肠NET中,PI3K-AKT信号通路参与直肠NET的发生发展,PI3K/AKT信号通路可能成为直肠NET治疗靶点,LRP2基因可能成为预后评估指标。Wnt及Notch信号通路参与了较高级别神经内分泌肿瘤的发生及发展。小结:本研究通过突变基因及信号通路改变结合临床病理特征将直肠NEN分为三种分子分型,发现LRP2基因突变患者预后较好,有助于患者预后评估及随访策略的制定。PARP抑制剂、MEK抑制剂及m TOR/AKT/PI3K抑制剂可能成为治疗转移性直肠NEN有效药物。结论:1.直肠NEC/Mi NEN、肿瘤分期较晚、肿瘤较大患者NLR及MLR值较高,更容易发生淋巴结转移,这类患者治疗前需要充分评估、积极治疗,手术后需要密切随访。2.病理分级、T分期、淋巴结转移、肿瘤距肛缘距离及NLR是影响直肠NEN患者预后的重要因素。3.本研究通过突变基因及信号通路改变结合临床病理特征将直肠NEN分为三种分子分型,发现LRP2基因突变患者预后较好。PARP抑制剂、MEK抑制剂及m TOR/AKT/PI3K抑制剂可能成为治疗转移性直肠NEN有效药物。