论文部分内容阅读
自噬是一种细胞内保守的蛋白及废物降解机制，同时也在细胞清除病原的过程中发挥重要作用。在不同病毒的感染过程中，自噬扮演了不同的角色。至今未见IBDV与自噬关系的研究。本研究中，我们以DF-1细胞为模型研究了IBDV与细胞自噬的关系。为了解IBDV感染DF-1细胞后自噬的变化情况，检测了IBDV感染细胞后内源性LC3以及GFP-LC3的变化情况。IBDV感染DF-1和293T细胞后，LC3-II在0-2小时表现为显著的上调，而在4-6小时下降。同样的， IBDV感染GFP-LC3转化的DF-1和293T细胞中，GFP-LC3在2小时呈现大量的点状分布，而在感染后4小时这些点状结构消失。P62在IBDV感染过程中出现了同步变化。这些数据证明在病毒感染早期DF-1和293T细胞的自噬被强烈诱导，在病毒感染4小时后，自噬水平被抑制。综上所述，IBDV感染在早期诱导了细胞的自噬，而后抑制了细胞自噬。何种因素导致了细胞在感染2小时内发生了自噬，为了解释这一现象，我们对病毒编码的蛋白影响自噬的情况进行了分析，证明仅VP2蛋白诱导细胞自噬。然而VP2蛋白通过何种途径诱导自噬？在研究中，我们发现病毒蛋白VP2能够抑制mTOR和AKT的活性。因此，推测VP2蛋白通过细胞表面某一受体连接mTOR/AKT通路，并诱导自噬。实验证明，受体蛋白Hsp90能够与IBDV VP2互作，并减弱Hsp90与AKT的互作，导致AKT和Hsp90的解聚，而抑制了AKT和mTOR的活性，这些数据证明ＩＢＤＶ通过其外壳蛋白ＶＰ２与宿主细胞蛋白Hsp90的互作并因此抑制AKT/mTOR信号途径活性而激活了自噬。为了进一步揭示IBDV感染细胞后，在激活自噬后又抑制自噬的现象，我们对自噬途径做了进行了进一步分析，证明IBDV VP3通过其CC1结构域与Beclin-1互作，并把Beclin-1从VPS34复合体中分离下来，从而抑制PI3P的形成。同时VP3能够促进AKT的磷酸化来促进mTOR的磷酸化。进一步实验发现，VP3能够诱导VPS34-AKT-PDK1复合体的形成。通过对VPS34的干扰敲低，发现AKT不再被磷酸化。通过PDK1抑制剂来抑制PDK1的活性，也能发现AKT不再磷酸化。因此，VPS34-AKT-PDK1复合体的形成对于IBDV/VP3诱导的AKT磷酸化是必须的。同时，发现PDK1抑制剂能够逆反因VP3而抑制的自噬，但是PDK1抑制剂无法恢复由VP3破坏的VPS34复合体，因此推测VP3主要是通过促进AKT的活性而非通过破坏VPS34-Beclin-1复合体的方式来抑制自噬的。本文系统的研究了IBDV感染前期和后期细胞自噬的变化情况，在IBDV侵入的过程中，细胞通过Hsp90来识别IBDV的外壳蛋白VP2，并因此引发mTOR依赖的功能性自噬过程。引发的自噬在清除病毒中起到重要的作用。而IBDV为了能够成功复制，在感染过程中，IBDV能够通过其VP3来促进VPS34依赖的AKT活性，并因此而阻断自噬，促进病毒的复制。因此，病毒蛋白VP2/VP3通过调控AKT/mTOR信号通路控制着IBDV感染下的自噬过程。