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自然流产（Spontaneous abortion,SA）是妊娠早期常见的并发症,发病机制复杂,50%的病因不明,其中60%与免疫异常相关。阴道、肠道菌群对女性生殖健康十分重要,研究发现某些妊娠相关疾病存在阴道和肠道菌群失调的情况,特定菌对不良妊娠结局具有可观的预测价值。SA作为早期妊娠障碍常见的并发症之一,与菌群的相关性研究较少。中医药治疗疾病疗效确切,越来越多研究证明肠道菌群是中药发挥作用的重要靶点之一。基于“肾主生殖”理论,补肾安胎法代表方减味寿胎丸治疗流产疗效显著,可通过改善黄体功能、增加ER、PR受体的表达、纠正母胎界面Treg/Th17免疫失衡等发挥效应,但肠道菌群是否为其治疗靶点之一尚不清楚。因此,本课题首先对不明原因SA和正常早孕（Normal pregnancy,NP）人群阴道分泌物、粪便样本进行16S r RNA基因测序,以期筛选能表征不明原因自然流产特征的阴道、肠道差异菌,另外检测两组人群同源蜕膜组织Treg/Th17细胞平衡相关指标,初步探讨阴道、肠道菌群与母胎界面免疫的关系;进一步以米非司酮流产模型大鼠为载体,研究减味寿胎丸通过肠道菌群-代谢物-免疫调节,发挥补肾安胎功效的可能作用机制。目的：1.比较不明原因SA患者和NP组阴道、肠道菌群结构及其与母胎界面Treg/Th17免疫平衡的关系。2.探讨减味寿胎丸通过肠道菌群-代谢物-免疫调节发挥补肾安胎作用的可能机制。方法：一、临床研究1.收集不明原因SA患者和NP人群阴道分泌物、粪便样本进行16S r RNA基因检测。比较两组人群阴道、肠道菌群组成、多样性,LEf Se分析筛选差异菌并进行功能预测,研究差异菌功能基因可能涉及的生物学途径。2.同源收集不明原因SA患者和NP人群蜕膜组织,WB检测Foxp3、RORγt蛋白表达,并与阴道、肠道菌群关联,初步探讨差异菌与母胎界面Treg/Th17免疫平衡的关系。二、基础研究1.构建米非司酮流产模型大鼠,使用减味寿胎丸进行干预,通过计算流产率、观察胚胎形态等评估补肾安胎药效。收集大鼠粪便样本进行16S r RNA基因检测,LEf Se分析筛选差异菌,使用PICURSTs软件进行差异菌功能基因的生物学途径预测。2.HPLC-MS技术进行粪便非靶向代谢物检测,筛选差异代谢物,并与肠道差异菌进行关联,明确减味寿胎丸对粪便代谢物的作用。3.流式细胞技术检测大鼠外周血Treg、Th17细胞百分比;WB检测蜕膜组织Foxp3、RORγt蛋白的表达;ELISA检测血清TGF-β、IL-6、IL-10、IL-17浓度,明确减味寿胎丸对Treg/Th17细胞平衡的作用,并将相关指标与差异菌、差异代谢物关联,初步探索减味寿胎丸对肠道菌群-代谢物-免疫调节的作用。结果：一、临床研究1.阴道菌群（1）不明原因SA和NP组阴道菌群在门和属水平上组成相似。（2）两组人群阴道菌群α多样性指数比较示:NP组与SA组相比,chao1和observed species指数降低（P<0.05）。（3）使用Binary Jaccard、Bray Curtis、Euclidean、Unweighted Unifrac距离计算得出的两组间物种相似性和分散性、丰度、进化关系差异明显（P<0.05）。（4）LEfSe分析发现SA组显著差异物种为Shuttleworthia;NP组显著差异物种为双歧杆菌科、双歧杆菌目、Scardovia、γ-变形菌纲等。（5）PICRUSt功能预测示:NP组差异菌功能基因主要富集于细菌对上皮细胞的侵袭功能;SA组差异菌功能基因主要富集于Ⅱ型聚酮骨架的生物合成、细胞因子受体、细胞因子及其受体的相互作用等途径。2.肠道菌群（1）两组人群肠道菌群在门和属水平上组成相似。（2）NP组和SA组相比,chao1、shannon、observed species、simpson、PD whole tree指数均无差异（P>0.05）。（3）基于Binary Jaccard和Unweighted Unifrac距离进行ANOSIM分析示两组人群肠道菌群差异明显（P<0.05）。（4）LEf Se分析发现SA组显著差异物种为α-变形菌、远洋杆菌目等;NP组显著差异物种为Rikenellaceae、Alistipes等。（5）PICRUSt功能预测示:NP组差异菌功能基因主要富集于二甲苯降解;SA组差异菌功能基因主要富集于细胞因子受体、细胞因子及其受体的相互作用等途径。3.不明原因SA母胎界面免疫平衡情况及其与差异菌的关联（1）SA组患者蜕膜组织中Foxp3蛋白表达低于NP组（P<0.05）,而RORγt蛋白表达则高于NP组（P<0.05）,SA组与NP组相比,Foxp3/RORγt表达明显降低（P<0.05）。（2）Foxp3蛋白的表达与肠道CladeIII菌、真杆菌ruminantium属、远洋杆菌目相对丰度呈负相关关系,与阴道大肠埃希菌-志贺菌、Scardovia菌等正相关（P<0.05）。RORγt蛋白的表达则与肠道远洋杆菌目、CladeIII菌相对丰度呈正相关关系,与阴道双歧杆菌科、双歧杆菌属、肠杆菌科、肠杆菌属、大肠埃希菌-志贺菌等负相关（P<0.05）。Foxp3/RORγt与差异菌的关系与Foxp3趋势相似。二、基础研究1.减味寿胎丸对米非司酮流产模型大鼠肠道菌群的影响（1）补肾安胎药效（1）模型对照组的流产率为50.54%,较阴性对照组明显升高（P<0.05）。阳性对照组和减味寿胎丸组的流产率分别为30.17%、33.09%,与模型对照组相比,分别下降了20.37%和17.28%（P<0.05）。（2）阴性对照组、阳性对照组、减味寿胎丸组和模型对照组相比,子宫及胚胎重量无明显差异（P>0.05）。（3）阴性对照组、阳性对照组和减味寿胎丸组子宫及胚胎外观优于模型对照组。（2）肠道菌群结构（1）各组大鼠在门和属水平上肠道菌群组成相似。（2）阴性对照组、阳性对照组、减味寿胎丸组分别于模型对照组相比,chao1、shannon、observed species、simpson、PD whole tree指数无差异（P>0.05）。（3）基于Binary Jaccard、Bray Curtis、Euclidean、Unweighted Unifrac、Weighted Unifra 5种距离进行ANOSIM分析示:各组大鼠差异明显（P<0.05）。（4）LEfSe差异菌筛选发现:阴性对照组的显著差异物种包括梭菌目、梭菌纲、瘤胃菌科等;模型对照组的显著差异物种包括普雷沃菌9、蛭弧菌属、Bdellovibrionaceae科等;阳性对照组的显著差异物种包括瘤胃菌gnavus属、短小芽孢杆菌属等;减味寿胎丸组的显著差异物种包括拟杆菌科、拟杆菌属、变形菌门、γ-变形菌纲等。（5）PICURSt功能预测发现:模型对照组差异菌功能基因主要富集于泛酸和Co A的生物合成、脂肪酸的生物合成、内质网的蛋白加工、氨基酸相关酶等途径;减味寿胎丸组差异菌功能基因主要富集于抗坏血酸和藻酸盐代谢、戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互转化、半乳糖代谢、果糖和甘露糖代谢、初级胆汁酸的生物合成、黄酮和黄酮醇的合成、次级胆汁酸的生物合成等途径。2.减味寿胎丸对流产模型大鼠粪便代谢物的影响（1）PCA分析提示阴性对照组、减味寿胎丸组与模型对照组相比,样本不能较好的分离,但阳性对照组与模型对照组有较好的区分度;基于PLS-DA和OPLS-DA分析,阴性对照组、阳性对照组、减味寿胎丸和模型对照组相比均展现了明显的差距。（2）基于VIP值和统计假设检验的方法对差异代谢物进行筛选,模型对照组与减味寿胎丸组相比,共筛选差异代谢物273个。（3）比较各组胆汁酸定量结果,发现与模型对照组相比,LCA、UCD和MCA含量在减味寿胎丸组增加（P<0.05）,SCDCA含量在阳性对照组中增加（P<0.05）。（4）UDCA含量与肠道霍尔德曼氏菌属、变形菌门、拟杆菌属等正相关（P<0.05）,与罗斯氏菌属等负相关（P<0.05）;LCA与霍尔德曼氏菌属、变形菌门等正相关（P<0.05）,与瘤胃菌NK4A214属、罗斯氏菌属负相关（P<0.05）;MCA与霍尔德曼氏菌属等正相关（P<0.05）,与罗斯氏菌属等负相关（P<0.05）。3.减味寿胎丸对米非司酮流产模型大鼠母胎界面免疫平衡的影响（1）流式细胞技术检测示阴性对照组外周血Treg细胞百分比较模型对照组升高,而Th17细胞百分比降低（P<0.05）,使用减味寿胎丸后可显著增加流产模型大鼠Treg细胞百分比,降低Th17细胞百分比（P<0.05）。（2）阴性对照组、阳性对照组、减味寿胎丸组较模型对照组,蜕膜组织中Foxp3蛋白表达增加（P<0.05）;阴性对照组和减味寿胎丸组RORγt蛋白表达则明显低于模型对照组（P<0.05）。（3）减味寿胎丸可增加血清TGF-β、IL-6含量,降低IL-10、IL-17含量（P>0.05）。（4）关联分析结果示:UDCA、MCA、LCA与IL6、RORγt、IL-17呈负相关,与IL-10、Foxp3、Foxp3/RORγt、TGF-β正相关;拟杆菌科与拟杆菌属与RORγt、IL-17负相关,与IL-10、Foxp3、Foxp3/RORγt正相关,与IL-6和TGF-β不相关;变形菌门和γ-变形菌纲与TGF-β、Foxp3/RORγt、Foxp3、IL-10正相关,与IL6、RORγt、IL-17负相关。结论：1.不明原因SA患者和NP人群中阴道和肠道菌群结构存在差异,相应差异菌可能通过“细胞因子及其受体的相互作用”等生物学途径与宿主发生联系。2.不明原因SA患者母胎界面存在Treg/Th17细胞失衡的现象,这可能是导致SA发生的原因之一。3.减味寿胎丸可能通过肠道菌群-代谢物-免疫调节的环节,介导肠道拟杆菌、变形菌等,增加LCA、MCA、UDCA的含量,纠正母胎界面Treg/Th17免疫失衡,起到补肾安胎的作用。