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研究目的随着传统抗生素的大量以及不正当使用，菌株耐药性等问题变得越来越严重。研究与开发高效、无毒的现有抗生素的替代品是当今科研领域的研究热点。抗菌肽（Antimicrobial peptides, AMPs)是生物体内经诱导产生的一类具有生物活性的小分子多肽，是宿主免疫防御系统的一个重要组成部分，具有广谱抗菌、抗真菌、寄生虫、包膜病毒及癌细胞等多种生物学功能，同时，抗菌肽有着独特的抗菌机制，细菌不易产生耐药性等特点，使得抗菌肽在替代传统抗生素方面显示了巨大潜力和广阔的应用前景。人防御素（Human defensins）属于抗菌肽家族，是人体内重要的内源性抗菌肽，是免疫防御系统的一个重要组成部分。其中，人β防御素4（human β-defensin，hBD-4）是由Jose-Ramon于2001年发现的人源β防御素，具有广谱抗菌活性，尤其对耐药性较强的葡萄球菌和铜绿假单胞菌都具备强大的杀灭活性，极有希望开发成为一种能杀灭多种耐药菌尤其针对葡萄球菌和铜绿假单细菌的新型抗生素。由于hBD-4天然含量少，且提取步骤繁琐，而化学合成成本又高，通过基因工程技术大量生产hBD-4无疑是最佳选择。因此，本研究旨在根据GenBank数据库hBD-4的成熟肽基因信息，全基因人工合成hBD-4的寡核苷酸片段，并对其理化性质、结构等进行生物信息学分析。同时，选用目前表达重组蛋白功能最强大的pET系统，构建原核融合表达体系，优化表达条件，为实现大规模生产具有生物活性的hBD-4以及进一步的研究开发打下基础。方法1.根据GenBank中公布的hBD-4的成熟肽基因序列，全基因人工合成hBD-4，并克隆至pET-28a，构建pET-28a-hBD-4重组原核表达载体；将pET-28a-hBD-4转化至E.coli Competent Cell JM109，通过质粒提取、1%琼脂糖凝胶电泳回收纯化以及测序，鉴定阳性克隆；2.使用DNAClub对hBD-4的核苷酸序列进行限制性内切酶位点分析，利用蛋白分析系统Expasy所提供的相应序列分析工具（ProtParam, InterProScan,SOPMA, Protscale）以及Cn3D4.1软件对hBD-4氨基酸序列进行分析以及结构预测；3.将阳性克隆转化至E. coli BL21(DE3)感受态细胞中，PCR检测阳性转化株；4.对pET-28a-hBD-4in E. coli BL21(DE3)进行小量诱导表达，利用SDS-PAGE及Western Blot进行鉴定；5.筛选重组蛋白表达的最佳条件，即确定重组蛋白的最佳诱导时间、最佳诱导温度以及最佳IPTG诱导浓度；6.鉴定重组蛋白的表达形式，大量诱导表达后，采用固定化金属离子亲和层析法（Immobilized metal ion chromatography, IMAC）纯化大量表达后的重组蛋白，透析浓缩后通过BCA法确定hBD-4的最终产量；7.通过琼脂糖孔穴扩散法初步测定hBD-4对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、志贺氏菌、普通变形杆菌和沙门氏菌的抗菌活性；利用微量稀释法，测定hBD-4对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度，并测定hBD-4对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生长曲线的影响；8.利用琼脂糖孔穴扩散法检测经煮沸处理、反复冻融处理以及酸碱处理后的hBD-4对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌活性的影响。结果1、成功构建了pET-28a-hBD-4in E. coli BL21(DE3)原核表达系统；2、 hBD-4只存在Alu I和Fok I两种限制性内切酶酶切位点，其理论分子量（NW）为5988.9Da，等电点（pI）为9.27，为两亲性的具有α-螺旋以及β-折叠复合结构的抗菌肽；3、 SDS-PAGE及Western Blot结果显示，hBD-4重组蛋白在E. coli BL21(DE3)中成功表达；4、确定了最佳诱导表达条件是：30℃，1mM IPTG浓度诱导6h。在此诱导条件下，目的蛋白主要以可溶形式表达，极少量以包涵体形式表达；5、表达上清通过Ni2+柱纯化，得到较纯蛋白，最终产量为316.33μg/ml；6、纯化后的hBD-4对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有较明显的抑制活性，而对志贺氏菌、普通变形杆菌和沙门氏菌的抑菌效果不明显。hBD-4对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的最小抑菌浓度分别为8~16μg/ml、8μg/ml，且具有剂量依赖性；7、热稳定性实验显示，hBD-4在沸水处理5min后，活性基本不受影响；10~20min后，活性略有降低；30min以上活性基本消失。耐冻融性试验显示，反复冻融6次后，抑菌活性并未受到较大影响。酸碱稳定性实验结果显示，hBD-4在pH值为6.0~9.0时，活性基本趋于稳定，当pH值小于6.0或大于9.0时，其活性逐渐降低，且在碱性条件下相对较稳定。结论本研究成功构建了pET-28a-hBD-4原核表达载体，重组质粒转至大肠杆菌后获得了较高产量的重组hBD-4蛋白，并具有良好的生物学活性和体外稳定性。该研究为实现hBD-4的大规模生产奠定了基础，同时也为hBD-4的后期研发与临床应用创造了条件。