蜕皮激素对于昆虫变态时中肠组织的凋亡与形成、脑的重塑、脂肪体的降解与重组、成虫盘的发育和丝腺的形成与凋亡等生理进程非常关键,其与许多内分泌激素协调配合,控制着昆虫的生长与发育。蜕皮激素滴度的改变能够影响昆虫细胞周期的变化,但其具体调控机制还不清楚。家蚕（Bombyx mori）是鳞翅目经济昆虫的代表,体内不仅具有正常的细胞周期,而且具有进行核内有丝分裂的独特的泌丝器官丝腺。因此,家蚕是研究蜕皮激素调控细胞有丝分裂和核内有丝分裂机制的理想材料。本研究系统的分析了蜕皮激素处理后家蚕BmN-SWU1细胞和丝腺细胞周期的变化,通过转录组学鉴定蜕皮激素处理丝腺细胞后的差异表达基因,筛选出蜕皮激素诱导的丝腺细胞核内有丝分裂调控的关键基因BmFoxO,系统分析了BmFoxO基因在BmN-SWU1细胞和丝腺细胞中的功能,最后通过转录组学和免疫共沉淀等实验手段解析BmFoxO基因对家蚕丝腺细胞核内有丝分裂的调控机制,为完善家蚕的细胞周期调控提供重要的线索,也可为蚕丝改良提供理论依据。论文获得的主要研究结果和结论如下:1、蜕皮激素对家蚕生长发育和家蚕细胞周期的影响为了探究蜕皮激素对家蚕生长发育及丝腺发育的影响,通过体内注射蜕皮激素的方法,对家蚕和丝腺的形态进行观察,发现蜕皮激素处理后家蚕幼虫的体长缩短、体型变小,而丝腺组织的中部丝腺和后部丝腺也明显变短变细;对家蚕幼虫的体重进行统计,发现注射蜕皮激素后12 h之前,幼虫的体重没有明显变化,24 h和48 h时,家蚕幼虫的体重显著变轻。利用Brd U标记技术统计丝腺细胞的DNA复制情况,发现注射蜕皮激素后Brd U标记的阳性细胞显著减少,说明蜕皮激素抑制了家蚕丝腺细胞的DNA合成速率。为了探究蜕皮激素对正常细胞调控机制和丝腺细胞调控机制的差异,MTT、流式细胞术的实验结果表明,蜕皮激素能够抑制BmN-SWU1细胞的增殖,使细胞周期逐渐阻滞到G2/M期,并且S期细胞数目逐渐减少;Brd U标记的实验表明,S期细胞数目的逐渐减少是因为DNA的复制受到了抑制。为了进一步探究蜕皮激素对细胞分裂期的影响,利用Tubulin抗体标记细胞骨架,统计分析显示,BmN-SWU1细胞经蜕皮激素处理后多核细胞数明显增多,表明BmN-SWU1细胞分裂过程受到影响,胞质分离发生了异常;为了明确蜕皮激素受体BmEc R在细胞周期调控中的功能,利用CRISPR/Cas9技术敲除BmEc R基因后检测对细胞周期的影响,发现单独敲除BmEc R基因对细胞周期没有明显的影响,但是敲除BmEc R基因细胞经蜕皮激素处理后,蜕皮激素的作用效果明显减弱,表明蜕皮激素通过BmEc R对细胞周期进行调控。2、转录组分析蜕皮激素处理后丝腺的差异表达基因为了探究丝腺细胞核内有丝分裂的机制,通过转录组获得了蜕皮激素处理后丝腺细胞的转录本以及正常丝腺细胞的转录本。首先,我们分析了正常丝腺细胞中细胞周期素和细胞周期素依赖性激酶的表达情况,BmCyclin D和BmCDK4未检测到表达,而BmCyclin A和BmCDK2的表达量最高,说明丝腺细胞核内有丝分裂的维持不依赖于BmCyclin D/BmCDK4复合物,而主要依赖于BmCyclin A/BmCDK2复合物;其次,为了分析蜕皮激素诱导的核内有丝分裂的调控机制,对差异表达基因进行筛选,并对DNA复制通路、Cyclin/CDK复合物和分裂期检验点的差异基因进行分析,DNA复制通路共鉴定到20个差异表达基因,且20个差异表达基因均被显著下调,表明蜕皮激素抑制了丝腺细胞的DNA复制通路;Cyclin/CDK复合物的差异表达基因共鉴定到6个蛋白激酶和5个周期蛋白,表达均被抑制,表明蜕皮激素减缓了细胞周期的整个进程;分裂期检验点的差异基因共鉴定到13个,其中,M期进入检验点的6个差异表达基因和染色体分离检验点的4个差异表达基因均被下调,纺锤体形成检验点的2个差异表达基因被上调,而负调控因子MAD1被下调,表明蜕皮激素抑制了丝腺细胞M期进入检验点和染色体分离检验点,激活了纺锤体形成检验点。进一步通过GO（Gene Ontology）数据库和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）数据库对所有差异表达基因进行分析:GO数据库富集分析发现上调基因主要富集在分子功能类,下调基因主要富集在分子功能类和生物学进程类,暗示着蜕皮激素对丝腺细胞核内有丝分裂的调控机制极其复杂;KEGG数据库富集分析发现差异基因被显著富集到104条信号通路中,其中,DNA复制通路是最为显著的一条信号通路,其余通路还包括FoxO信号通路、Notch信号通路、错配修复通路和MAPK信号通路等。蜕皮激素能够显著上调丝腺细胞BmFoxO的表达,BmFoxO在丝腺细胞各时期的表达模式与蜕皮激素滴度变化趋势相似,且FoxO信号通路能够对细胞周期进行直接调控。因此我们选择BmFoxO作为候选基因进行深入研究。3、候选基因对BmN-SWU1细胞和丝腺细胞周期的影响首先,我们对蜕皮激素和BmFoxO基因的直接调控关系进行验证,通过免疫荧光、免疫印迹和q RT-PCR的实验结果,证实了蜕皮激素不仅可以诱导BmFoxO入核,还可上调BmFoxO基因的转录水平,进而对BmFoxO基因进行直接调控。其次,通过过表达和敲除等实验手段探究了BmFoxO基因对家蚕BmN-SWU1细胞周期的影响。MTT、流式细胞术和Brd U标记等说明BmFoxO基因能抑制细胞的增殖,诱导细胞周期阻滞到G0/G1期,抑制DNA的复制;通过Tubulin标记说明BmFoxO基因能够促进M期的细胞迅速进入下一时期。最后,探究了BmFoxO基因在丝腺细胞中的功能,通过对BmFoxO基因在丝腺各时期的相对表达量进行分析,发现BmFoxO基因在胚胎期24期、25期和26期表达量持续上升,暗示着BmFoxO基因可能参与了丝腺细胞有丝分裂向核内有丝分裂转化的过程;而BmFoxO基因在DNA复制最为旺盛的五龄阶段表达量较低,说明BmFoxO基因可能参与了丝腺细胞核内复制的进程。因此,我们在家蚕五龄期的丝腺中过表达BmFoxO基因,利用Brd U标记技术探究丝腺细胞DNA复制情况,发现过表达BmFoxO基因后,丝腺细胞Brd U标记的阳性细胞占比明显减少,说明BmFoxO基因能抑制丝腺细胞的DNA合成速率。4、BmFoxO基因对家蚕丝腺细胞核内有丝分裂的调控机制解析为了寻找BmFoxO基因的上游调控因子,通过文献查阅以及转录组分析,筛选到胰岛素信号通路可能是BmFoxO基因的上游调控通路。通过转录组数据及q RT-PCR的实验,证明了蜕皮激素能够下调丝腺细胞中胰岛素信号通路的PI3K信号通路和MEK/ERK信号通路,上调BmFoxO基因的表达。为了验证胰岛素信号通路对BmFoxO基因的调控作用,我们通过免疫荧光、免疫印迹和q RT-PCR等实验手段进行证明,结果发现,胰岛素能够诱导在细胞核里的BmFoxO蛋白出核,也能抑制其转录水平,进而对BmFoxO基因进行直接调控。综合上述结果,推测蜕皮激素通过抑制胰岛素信号通路,上调BmFoxO基因进而对丝腺细胞核内有丝分裂进行调控。为了探究BmFoxO基因的下游调控因子,我们进行了如下的研究。发现蜕皮激素对进行不同周期形式的BmN-SWU1细胞和丝腺细胞中BmCyclin B的调控不同,蜕皮激素上调BmN-SWU1细胞中BmCyclin B的表达,却下调丝腺细胞中BmCyclin B表达。表明BmCyclin B可能是蜕皮激素调控丝腺细胞核内有丝分裂的关键下游基因。之后,我们探究了BmFoxO和BmCyclin B的调控关系,通过免疫荧光、免疫印迹和q RT-PCR等证明了BmFoxO能够诱导内源BmCyclin B入核,并上调其转录水平和蛋白水平。进一步免疫荧光和免疫共沉淀的实验证明,BmFoxO与BmCyclin B能够互作。此外,我们还证明了BmFoxO能够与M期的细胞周期素依赖性激酶BmCDK1和BmCDK10相互作用。通过q RT-PCR的实验结果进一步说明BmFoxO基因能够上调BmCyclin B、BmCDK1和BmCDK10的表达。综上,BmFoxO基因可能通过促进胚胎期丝腺细胞BmCyclin B、BmCDK1和BmCDK10的表达,从而加速M期的进程,使M期迅速过渡到G期,从而完成有丝分裂向核内有丝分裂的转化。