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研究背景:青光眼是世界性的第二大致盲性眼病,全世界受累人数约为6千7百万人。其中,约10%的患者为双眼盲。在中国,青光眼也是成年人致盲的主要原因之一。根据发病原因的不同,青光眼可分为原发性青光眼和继发性青光眼两种。原发性青光眼又可主要区分为三类:原发性先天性青光眼、原发性开角型青光眼和原发性闭角型青光眼。原发性先天性青光眼(primary congenital glaucoma,PCG)是一种好发于婴幼儿的遗传性致盲性眼病,是先天性青光眼中最为常见的类型,男女发病率比例约为2.7:1,多为散发,治疗效果较差,并最终导致视神经受损、萎缩而致盲,无法再次复明。该病多同时或先后累及双眼。被认为是由于前房角特别是小梁网的先天发育异常,导致房水的正常排流过程受阻,造成眼压病理性升高以及眼球的解剖结构和生理功能随之受到损害或破坏的一种婴幼儿性青光眼,它也被称为原发性婴幼儿性青光眼或婴幼儿型青光眼。PCG发病年龄一般在3岁以内,是婴幼儿青光眼中最见的类型,大约每1万个活产儿中有一个患该型青光眼。对于3岁以前的儿童,由于角巩膜可塑性比较大,因此,3岁前即有眼压病理性升高,患儿常有典型眼角膜、眼球变大的表现,扩张变大的眼球类似牛的眼球,故也称其为牛眼(Buphthalmos)。在排除其它眼部和全身异常后,青少年或成人的牛眼表现可作为PCG的诊断依据之一。当患儿出现一侧眼睛或双眼角膜直径>12mm或角膜出现哈氏纹、眼压>2lmmHg或出现视杯/视盘比值改变,并有溢泪、畏光、视力下降、牛眼等临床表现时,排除其它先天异常后可确诊为PCG。PCG的发病率依地域和人群不同而不同:在西方国家的发病率约为1:10,000,印度东南部的安得拉邦发病率要高一些,约为1:3300,沙特阿拉伯为1:2500,罗马的斯洛伐克人为1:1250,在以色列贝都因人的发病率高达1:1200,在我国,关于PCG的人群研究数据相对较少见,至今未见我国PCG的发病率等人群数据的报道。对于PCG的发病原因和机制,到目前为止,共报道了三个与原发性先天性青光眼相关的基因座GLC3A、GLC3B、GLC3C,但是仅在GLC3A上找到了一个致病相关基因CYP1B1,并认为CYP1B1基因与原发性先天性青光眼有着密切的联系。对CYP1B1基因与PCG的相互关系进行研究为揭示原发性先天性青光眼致病基因,在分子层面找寻PCG的致病原因提供线索,也为PCG的病因学研究带来了希望和光明。目前关于PCG的研究主要都是国外学者们完成的,研究表明:CYP1B1基因编码细胞色素P4501B1,是导致PCG的最主要原因。在国内,PCG相关报道尤其是关于PCG和CYP1B1基因的研究报道较为少见,因此,研究中国人PCG患者与PCG致病相关基因CYP1B1基因的关系具有重要意义。目的:1.运用高分辨率熔解曲线方法检测CYP1B1基因高频变异区域;2.广东地区汉族正常人CYP1B1基因序列的获取及其序列特点分析,对于我们了解中国广东地区汉族正常人CYP1B1基因序列及其特点,掌握正常人CYP1B1基因基础数据十分重要。该数据的获取将为广东地区人群CYP1B1基因的研究提供正常人群基础数据,为CYP1B1基因与相关疾病特别是PCG的相关研究提供基础正常参照数据,对筛选CYP1B1基因疾病相关变异提供正常对照对照,为探讨CYP1B1基因与PCG之间的关系奠定基础;3.在广东地区汉族正常人CYP1B1基因序列的基础上,找寻PCG患者CYP1B1基因除热点突变区域以外的可能的与PCG疾病相关的基因变异位点。材料及方法:1.抽取外周静脉血制备基因组DNA,采用聚合酶链反应(Polymerase chain Reaction,PCR)及高分辨率熔解曲线方法(High-Resolution Melting, HRM)对CYP1B1热点突变区域进行筛查。对所筛查片段进行直接测序,以验证HRM的检测结果;2.采用聚合酶链反应对正常对照CYP1B1全基因进行扩增、测序、序列拼接、同源对比性分析、多系列比对分析、变异位点归纳,为中国广东地区汉族CYP1B1基因变异引起PCG发病提供对照;3.采用聚合酶链反应对PCG患者CYP1B1全基因进行扩增、测序、序列拼接、同源对比性分析、多系列比对分析、变异位点归纳,从基因整体上分析CYP1B1的基因特性,找寻中国PCG患者在基因上的致病线索。结果:1.在46.2%(6/13)的PCG患者中发现7种不同的CYP1B1变异,其中3种为新检测出的变异:g.2862G→T(Q159H),g.6549A→G(N377D),g.6598G→A(S393N);4种已报道过的变异:g.2527C→G(R48G),g.2740G→T(A119S), g.6589G→A(R390H), g.6767C→T(D449D)。7种变异均位于编码区,g.2527C→G(R48G),g.2740G→T(A119S),g.2862G→T(Q159H)位于第二外显子,g.6549A→G(N377D),g.6589G→A(R390H),g.6598G→A(S393N)g.6767C→T(D449D)位于第三外显子。在正常对照中未检测到g.2862G→T(Q159H),g.6549A→G(N377D),g.6589G→A(R390H),g.6598G→A(S393N)。2.本次正常对照CYP1B1全基因扫描共发现24种CYP1B1基因变异,且绝大部分位于非编码区,只有2种(g.2740G﹥T、g.6983T﹥C)位于CYP1B1编码区。其中g.6983T﹥C目前在国内外文献中未见报道。g.1274T﹥C,g.1385C﹥T位于侧翼,g.2123G﹥A,g.2373C﹥T位于第一内含子,这四种变异位点在其他人种的CYP1B1全基因变异中均有过报道。g.7162A﹥G及g.7533G﹥A位于第三外显子,但不编码蛋白质。剩余16种CYP1B1变异全部位于第二内含子。3.在PCG病例组共发现134种CYP1B1基因变异。变异位点分析详见讨论。结论:1.⑴在46.2%(6/13)的PCG患者中发现7种不同的CYP1B1变异,均位于编码区,其中3种为目前国内外文献均未见报道过的变异;⑵g.2527C→G(R48G),目前在国内外均报道为CYP1B1基因SNPs位点。我们不排除该变异与中国广东地区汉族PCG发病存在相关性的结论。2.⑴获取广东地区汉族正常人CYP1B1基因的基础数据;⑵序列分析表明:广东地区汉族正常人CYP1B1基因共发现24种基因变异位点,其中17种在国内外文献中未见报道。这24种CYP1B1基因变异位点不引起PCG。3.⑴在PCG病例组共发现134种CYP1B1基因变异;⑵排除18种可致CYP1B1基因结构或功能异常的变异位点,尚有116种未能确定是否会导致PCG发病;