研究背景阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种神经退行性疾病,也是老年人痴呆中最常见的类型,,其中占痴呆患者总数的60%以上。临床表现有记忆障碍、执行功能障碍以及人格和行为改变等。AD主要有3种不同的神经病理表现：细胞内的神经纤维缠结、细胞外的老年斑和神经元的丢失。神经纤维缠结是由于细胞内高度磷酸化的微管相关蛋白tau的聚集。过度磷酸化的tau蛋白促进微管蛋白聚集和组装能力降低,导致微管稳定性下降。tau蛋白磷酸化受蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶调节,皮层神经纤维缠结的分布和数目与认知障碍呈正相关,是疾病进展的标志。细胞外的老年斑是由p-淀粉样蛋白(amyloid β, amyloid β)聚集形成的。细胞外β-淀粉样蛋白斑块见于AD患者脑内的大部分区域,并与嗅皮层、海马及相关皮质内神经元的丢失有关。在脑内斑块的数量与痴呆严重程度无关,脑内Ap的总量水平与认知减退有关。Ap增加了tau磷酸化,并且启动多个途径导致神经元的死亡。AD脑内神经元和突触变性多发生在高密度的淀粉样斑和纤维缠结区域。受累严重的区域包括海马、嗅皮质、杏仁核、新皮层和皮层下区域,海马和额颞顶叶的谷氨酸能神经元受累较重,而在运动和感觉皮层的类似神经元相对保留。因为海马和皮层与学习记忆有关,很可能谷氨酸能神经元的变性是AD发病中的早期事件。近来的研究显示谷氨酸能突触前密度降低与认知障碍的相关性要超过纤维缠结和Aβ负荷。AD动物模型的研究发现胆碱能突触前小结的上调发生在谷氨酸能突触末端受累之前,很可能胆碱能系统影响了脑内谷氨酸能神经元的功能和生存。以谷氨酸作为主要神经递质皮层的椎体神经元具有胆碱能和谷氨酸能两种受体,并接收来自基底前脑胆碱能神经元的信息输入。AD患者尸检额叶皮层内,突触后毒蕈碱M1和G-蛋白的解偶联与NMDA受体密度和蛋白激酶C的活性下降有关。这些研究都提示胆碱能系统和谷氨酸能系统互相作用,并可能激发了AD的病理异常。这也说明,谷氨酸能系统与AD中的Aβ和tau蛋白之间存在某些联系并互相作用。谷氨酸在中枢神经系统内的突触传递、神经元生长和分化、突触可塑性、学习和记忆等方面都发挥重要作用,也是哺乳动物中枢神经系统内主要的兴奋性神经递质。谷氨酸能神经元在神经系统均有分布,但他们主要分布在大脑皮层和脑的边缘系统。谷氨酸能系统通过控制突触内的谷氨酸的浓度将神经冲动转化为化学刺激。在突触前神经元,囊泡谷氨酸转运体VGLUT1和VGLUT2将谷氨酸储存于囊泡中。当神经元去极化时,谷氨酸自谷氨酸能神经末梢释放,在不同的谷氨酸能受体间进行信号转导,然后从突触间隙回收。过多的谷氨酸在细胞外累及会引起谷氨酸受体的过度刺激,增加活性和兴奋毒性氧氮类物质生成,,进而氧化应激导致神经元死亡。突触间隙内谷氨酸的浓度和作用时效受精确调控以维持其稳态并防神经元的死亡。高结合性钠依赖转运体系统可重新摄取脑内的谷氨酸病维持其适当浓度以避免产生兴奋毒性。谷氨酸浓度升高与多种神经系统疾病有关,如癫痫、卒中、神经变性病等。谷氨酸的清除主要由Na+依赖高结合力的转运体实现。突触间隙内的谷氨酸浓度和触发的突触后离子型谷氨酸受体活性二者共同参与这一调控过程。EAATs类似于离子通道的膜结合泵。这些转运体对于调节细胞外间隙的谷氨酸浓度保证正常的生理功能避免神经毒性起着重要作用。谷氨酸释放产生动作电位后,谷氨酸转运体很快将其从细胞外隙移除,使其保持在低水平状态,从而终结突触传递。谷氨酸的跨膜移位是一个逆离子梯度耗能的过程,因此EAATs又可称为转运子。转运循环起自于底物分子的结合,当有一个谷氨酸被转运至细胞内的时候,2个钠离子和一个氢离子结合在转运体的细胞膜外部分,并激发一系列级联反应,转运体的内侧面释放钠离子、氢离子和底物进入细胞质。通过共同转运一个钾离子,转运体回到转运体细胞膜外,以便于细胞突触内底物分子的结合。目前已发现Na+依赖高结合力的谷氨酸转运体有五种,这些转运体50-60%的氨基酸序列同源。通过对细菌谷氨酸转运体晶体结构研究发现,谷氨酸转运体接近于三聚体,有8个跨膜区域。三种发现源自小鼠脑内：GLAST,GLT-1口EAAC1(依次又称为EAAT1, EAAT2和EAAT3); GLT-1由于nRNA的选择性剪切使得羧基和氨基端序列不同,形成不同的变异型。另外两种源自人和啮齿类动物：EAAT4和EAAT5。GLAST和GLT-1转运体因其主要位于星形胶质细胞膜表面,因此又称为星形胶质细胞转运体。定量电镜分析显示GLAST和GLT-1分布在突触末端星形胶质细胞的足突上,提示二者分布在临近突触的细胞膜上。但GLT-1蛋白和突触囊泡蛋白突触素共存。这可以推测二者在星形胶质细胞的分布并非完全一致。这两个转运体也发现在少突胶质细胞和巨噬细胞上。此外,发育中的神经元、成人神经元和培养的原代神经细胞上也发现了这两个转运体。EAAT3和EAAT4被认为是神经元的转运体,但发现它们只分布在很多神经元的突触后膜,不参与神经递质的再循环。EAAT3在脊髓的突触后密集区(post-synaptic density)分布较少,而在突触前膜分布较多。EAAT3富集于海马皮层的椎体神经元,也发现表达在谷氨酸能神经元、GABA能神经元以及少突胶质细胞,但是在星形胶质细胞表达很少。EAAT4认为表达于GAB A能浦肯野细胞和星形胶质细胞。EAAT5主要分布在视网膜的棒状感光体和双极细胞。上述五种氨基酸转运体在脑内不同结构分布亦不同。GLAST免疫组化和蛋白表达主要位于小脑以及海马和前脑。GLT-1主要表达在前脑,少量表达在小脑。EAAT3在脑的多个区域都有低水平地表达。EAAT4和EAAT5相对地主要表达在小脑和视网膜。谷氨酸转运体失效常常可以触发并导致瀑布式的脑损害。β-内酰胺酶类药物作为临床使用的重要抗生素之一。Rothstein等于2005年筛选了FDA批准的药品,以在其中寻找到能够提高神经保护蛋白GLT1体外表达的药物。结果发现β-内酰胺酶类以浓度依赖的方式能够提高GLT1蛋白的表达。GLT1能够通过将神经递质谷氨酸从突触间隙中移除,从而抑制兴奋性氨基酸的神经毒性作用。在转基因小鼠中,增加谷氨酸转运体的表达,GLT1可实现在正常和异常神经传递中的整合作用。β-内酰胺酶类诱导转录因子NF-κB的活化,活化的NF-κB连接于GLT1启动子区域,从而上调GLT1基因的转录,从而降低突触间隙内谷氨酸的浓度并弱化谷氨酸过多产生的神经毒性。治疗肌萎缩侧索硬化的唯一药物利鲁唑(riluzole)同样是GLT1表达的激动剂,该药物在体外实验中证实了GLT1—谷氨酸—神经变性这一演进模式。目前已经发现p-内酰胺酶类药物在11种疾病的体内或体外试验中能够增加GLT1的表达,从而发挥神经保护作用。在谷氨酸/GLT1相关神经疾病的体内试验中,头孢曲松被证实是最有效的神经保护剂。头孢曲松的明显优势是能够穿透血脑屏障进入脑内。材料与方法3月龄健康雄性APP/PS1小鼠,由中国医学科学院实验动物研究所提供,12h昼夜循环光照,24℃恒温,60%湿度,自由进食水1月。4月龄野生型雄性C57BL/6小鼠作为对照使用小鼠。体重25-29g。WT+NS组：4月龄野生型雄性C57BL/6小鼠8只,不予以注射任何药物或试剂；WT+Cef组：4月龄野生型雄性C57BL/6小鼠8只,以腹腔注射头孢曲松200mg/kg qd×7天；APP/PS1+NS组：4月龄健康雄性APP/P S1小鼠8只,以腹腔注射0.2m1生理盐水；APP/PS1+Ce f组：4月龄健康雄性APP/PS1小鼠8只,以腹腔注射头孢曲松200 mg/kg qd×7天。四组之间小鼠体重月龄无明显差异。药物干预后,继续喂养小鼠7天。试验结束后给予3%苯巴比妥钠腹腔注射(40 mg/100 g),小鼠麻醉取脑,留取海马组织备用。均在大致相同的海马结构断面上选取切片。行Cresyl violet染色,光镜下通过尼氏染色观察大鼠海马CA1区神经元形态和数目。海马区Aβ斑免疫组织化学染色。Western blotting检测GLAST蛋白和GLT-1蛋白的表达。RT-PCR法GLAST mRNA和GLT-1mRNA的表达。研究结果1.大鼠海马CA1区神经元Cresyl violet染色观察：野生正常组海马CA1区神经元形态较规则,排列整齐而致密,层次多,细胞核大而椭圆形,核仁明显,细胞间隙清楚,尼氏体非常丰富。APP/PS1组海马CAl区神经元排列紊乱不规则,层次减少,神经细胞出现脱失,细胞界限不清晰,胞体大小不规则,存在肿胀和缩小,胞核皱缩深染,核仁不清；部分胞核固缩明显,可见核碎裂。经头孢曲松干预后神经元细胞数及形态无明显变化。2.海马区淀粉样斑的观察：APP/PS1转基因小鼠Aβ斑的表达与正常野生小鼠比较明显增加(P>0.05),正常野生小鼠脑内各区域没有发现Ap斑的存在。APP/PS1转基因小鼠在使用头孢曲松干预后Aβ斑的表达与对照组比较没有显示明显降低(P>0.05)。3.Western blotting检测GLAS T蛋白和GLT-1蛋白的表达：APP/PS1转基因小鼠GLAST和GLT-1蛋白的表达与正常野生小鼠比较明显降低(P<0.05)。APP/PS1转基因小鼠在使用头孢曲松干预后GLAST蛋白的表达与对照组比较没有显示明显变化(P>0.05),头孢曲松干预后的GLT-1蛋白的表达与经生理盐水干预的对照组相比较有统计学意义(P<0.05)。4. RT-PCR法GLAST mRNA和GLT-1mRNA的表达：APP/PS1转基因小鼠GLASTmRNA的表达与正常野生小鼠比较没有显示明显降低(P>0.05),但APP/PS1转基因小鼠GLT-1mRNA的表达较正常野生小鼠显示明显降低(P<0.05)。APP/PS1转基因小鼠在使用头孢曲松干预后GLAST mRNA的表达与对照组比较没有显示明显增加(P>0.05),头孢曲松干预后的GLT-1mRNA的表达与经生理盐水干预的对照组相比较有统计学意义(P<0.05)。研究结论1.APP/PS1转基因小鼠海马CA1区海马神经元数目减少,淀粉样斑沉积。2.APP/PS1转基因小鼠海马区GLAST蛋白和GLT-1蛋白表达减少。3.头孢曲松能够上调APP/PS1转基因小鼠海马区 GLT-1mRNA和GLT-1蛋白的表达。