论文部分内容阅读
茶多酚是茶树[Camellia sinensis（L.）O. Kuntze]中主要的次生代谢产物，其含量可达鲜叶和嫩茎干重的18%～36%，包括酚酸、黄酮醇、黄烷-3-醇（儿茶素）、黄酮、花青素和原花青素等。不同酚类物质的生物合成主要途径基本相同，涉及到莽草酸途径、苯丙烷类代谢途径和类黄酮合成途径。花青素还原酶（anthocyanidin reductase，ANR）是控制儿茶素和原花青素合成的直接酶类，而苯丙烷类代谢途径和类黄酮合成途径中的许多酶促反应受到转录因子R2R3-MYB, bHLH和WD40蛋白的调控。有关茶树转录因子基因功能研究几乎未见报道，茶树ANR基因的功能也不能确定。本文重点对初步测得的茶树基因组中转录因子基因进行生物信息学分析，并利用烟草遗传转化体系对茶树ANR基因功能进行验证。主要研究内容如下：1.初步测得的茶树基因组中转录因子R2R3-MYB, bHLH和WD40蛋白的生物信息学分析。从茶树基因组中127,094条单一基因中筛选转录因子基因，并逐一进行保守结构域鉴定，分别筛选得到73条R2R3-MYB基因，49条bHLH基因和134条WD40基因。为了预测基因的功能，将73条茶树R2R3-MYBs和126条拟南芥R2R3-MYBs合并到一起构建进化树。进化树结果显示，拟南芥R2R3-MYB可分为25个亚组，茶树R2R3-MYB可分成27个亚组，茶树R2R3-MYB可以整合到拟南芥的进化枝中，但是比拟南芥多两个亚组。利用MEME网站软件，对茶树R2R3-MYB亚组的基序进行了重新定义。根据进化树分支和基序推测，6条第4亚组茶树R2R3-MYB可能参与负调控酚酸代谢和单宁合成，2条第5亚组茶树R2R3-MYB可能参与调控原花青素合成，1条第7亚组茶树R2R3-MYB可能参与调控黄酮醇合成。同样，将拟南芥和茶树bHLH放在一起构建进化树。进化树结果显示，拟南芥bHLH可以分为32个亚组，茶树bHLH分布在其中9个亚组中。参照拟南芥的功能注释，茶树中2条第2亚组bHLH、5条第24亚组bHLH蛋白可能参与调控类黄酮合成途径。基序分析还发现，CsMYB4-1、CsMYB4-2、CsMYB4-3、CsMYB4-4、CsMYB5-1和CsMYB5-2的序列中包含[DE]Lx2[RK]x3Lx6Lx3R基序，该基序特定结合bHLH，有助于形成稳定的MYB–bHLH复合物，提示这些MYB蛋白可能与bHLH一起发挥作用。因存在较大的进化差异，茶树WD40蛋白无法构建进化树，然而从中我们也找到1条与AtTTG1高度同源的CsWD40-1，两者序列一致性为80.4%，提示它可能参与调控类黄酮的合成。2. R2R3-MYB, bHLH和WD40转录因子基因的克隆和表达分析。本论文对筛选出来的转录因子基因进行了全长序列的End-to-end PCR验证，部分基因通过了RACE-PCR验证。同时通过荧光定量PCR分析（qRT-PCR）技术分析了筛选出的转录因子基因在茶树不同发育阶段和不同处理条件下，包括ABA、GA及伤害处理条件下的表达差异。并预测了在类黄酮合成途径中可能的靶结合位点。3.茶树基因组的ANR基因启动子克隆、生物信息学及其表达分析。在茶树基因组中查找到2条与GU944768和JN024667一致的ANR基因，并命名为CsANR1和CsANR2。进化树显示CsANR1和CsANR2与VvANR和DkANR同源性最高，蛋白结构分析CsANR1和CsANR2与葡萄ANR的晶体结构3hfsB的一致性最高，并推测了茶树ANR的NADPH结合位点、底物结合位点及催化位点。克隆得到CsANR1和CsANR2的启动子，分别有2464bp和1500bp，发现两个ANR启动子中都存在很多响应光、激素、环境胁迫的顺式作用元件。qRT-PCR技术分析了CsANR1和CsANR2在茶树不同组织和不同处理中的表达模式，结果发现，CsANR1和CsANR2在芽、四叶和根中表达量比较高；对光照和蔗糖响应明显；对激素和伤害处理响应不明显。4.茶树CsANR1和CsANR2基因的功能验证。转CsANR1和CsANR2烟草植物花的花色出现不同程度的变浅，其中转CsANR1的烟草花变浅明显；同时发现，转基因烟草花中的花青素含量下降，而原花青素含量升高。通过qRT-PCR对转基因烟草中类黄酮合成途径相关基因进行分析，结果发现，在转CsANR1的烟草花中，CHS、CHI、F3’H基因都被下调，其中F3’H下调最为明显，ANS基因上调最为明显。在转CsANR2的烟草花中，CHS、CHI、F3H、ANS、DFR基因的表达量明显下降，F3’H的表达量明显升高。5.可能参与调控茶树CsANR的转录因子CsMYB5-2的功能验证。生物信息学分析表明，CsMYB5-2与DkMYB4（BAI49721）和PtMYB115（EEE81917）的亲缘关系较为密切。转CsMYB5-2的烟草植物花中DMACA显色的原花青素含量出现明显的提高。通过qRT-PCR对转基因烟草中类黄酮合成途径相关基因进行分析，结果显示，在转CsMYB5-2的烟草花中ANR基因的表达量明显上升。