血管是十分重要的组织器官,它能为全身各个部位输送氧及营养物质。在机体组织损伤,特别是血管损伤中,其致残率、死亡率均较高,往往会造成患者缺血部位坏死甚至死亡。特别是近些年来,脑血管疾病、切割伤、骨折、脱位伤及火器伤等的发病率增高,使血管移植物(Vasculargraft)的缺乏成为目前亟待解决的难题。生物材料的价值在于修复和替代人体无法自行修复的组织和器官,增加新生血管的形成无疑会提高和改善生物材料在创伤修复方面的功能。因此,促血管发生材料的研究是生物材料研究的一项重要内容。理想生物材料的功能与细胞外基质修复组织功能颇为相似。从现代分子和细胞生物学的角度研究学习细胞外基质分子调控血管发生和自行修复组织的基质,肯定会为促血管发生材料的研究提供新的思路。血管生成(Agiogenesis)是指在机体生长发育过程中或创伤修复、缺血缺氧和炎症等情况,原有微血管内皮细胞(Endothelial Cell,EC)经过生芽、迁移、增殖与基质重塑等形成新毛细血管的过程,涉及血管壁细胞的增殖、迁移、粘附、ECM的形成与组装等过程,受多种生长因子调控。已经证实,Perlecan(硫酸乙酰肝素)参与细胞增殖、脂蛋白摄取、细胞粘附和ECM组装,在调节血管生物学行为和损伤修复中具有重要作用。最新研究发现Perlecan参与血管生成的调节,因为它具有储存、保护和加强血管发生因子的功能。因此,将Perlecan引入促血管发生生物材料研究是一个新颖和极具探索价值的课题。本课题模拟细胞外基质的构成,研究构建新型自组装(Self-assembly)促血管发生材料。其最大的优点就是仿生性和智能性(Biomimic and Smart Materials),可以根据机体的需求调整状态和功能。同时,本课题致力于解决血管发生的有效性和功能性两个关键的科学问题,这样不仅可以提高现有生物材料和组织工程支架的性能,还很可能成为一种有效的治疗手段,为临床应用提供理论指导。因此,本研究将会在促血管发生材料研究的关键问题上取得突破,使该新型材料具有重要而广泛的应用价值。研究内容如下:1. Perlecan的制备和纯化Perlecan是HSPG的一种形式,但由于HSPG形式多样,并不容易的到较为单纯的Perlecan蛋白。通过亲和层析的方法对其进行纯化。经过SDS-PAGE法分析,最终获得到纯化Perlecan。2. VEGF-165与Perlecan结合的研究通过斑点印记实验来检测Perlecan与VEGF结合的特性。应用抗VEGF-165的抗体来检测其与Perlecan结合的情况。在纤维素膜上,可以清晰看到Perlecan与VEGF-165的结合能力显著高于对照组,说明Perlecan具有促血管生长因子储备库的功能,它的HS侧链上具有VEGF的结合位点,可以与VEGF发生特异性的结合,是VEGF的良好载体。3.生物素Perlecan与Ⅰ型胶原结合固相结合实验检测生物素化的Perlecan(生物Perlecan)与Ⅰ型胶原纤维的结合。固定的Ⅰ型胶原纤维和可溶的生物Perlecan一起培养,从而判断Perlecan能否与Ⅰ型胶原纤维结合。生物Perlecan与Ⅰ型胶原纤维在饱和情况下可以相互作用,产生特殊的结合。相反的,生物Perlecan很难与BSA相互作用,仅仅表现少许非特异性结合。(p<0.001)。4. Perlecan对生物素Perlecan与Ⅰ型胶原结合的影响自然Perlecan(非生物Perlecan)对于生物Perlecan常表现出竞争性的与Ⅰ型胶原纤维结合。当增大Perlecan/生物Perlecan的质量比时,生物Perlecan就会从Ⅰ型胶原纤维的结合中游离出来。这说明生物Perlecan中的Perlecan成分助于与Ⅰ型胶原纤维结合。5. HS对Perlecan与Ⅰ型胶原结合的影响评估是否Perlecan中的硫酸乙酰肝素成分间接的与Ⅰ型胶原纤维反应,可以用可溶性的硫酸乙酰肝素竞争生物Perlecan与Ⅰ型胶原纤维的结合。HS改变了生物Perlecan的结合特性,并且当HS的浓度增加到100μg/ml时生物Perlecan能明显的从底物中游离出来。这说明Perlecan的硫酸乙酰肝素链对于Perlecan与Ⅰ型胶原纤维的结合起到重要作用。6. Perlecan与不同结构Ⅰ型胶原结合研究Ⅰ型胶原的物理性状对Perlecan的影响,在96孔微型板置入Ⅰ型胶原纤维,凝胶(变性的Ⅰ型胶原)和Ⅰ型胶原单体(酸离散)。结果说明,生物Perlecan与Ⅰ型胶原纤维的结合远远多于与凝胶和Ⅰ型胶原单体的结合(p<0.001)。本试验中,生物素Perlecan与BSA的结合能力是最低的。7. VEGF-165与P/C复合物的结合固相结合和ELISA试验用于测定VEGF-165与不同底物的结合的特性。底物(Ⅰ型胶原纤维,P/C复合物,明胶和Ⅰ型胶原单体)固定在96孔板上之后,用含3%(w/v)BSA的PBS液阻断,阻断后,将VEGF加入到每一个孔中,在室温中培养2h。PBS液冲洗3次,抗VEGF抗体与HRP耦合,VEGF Quantikine ELISA试剂盒的色度法来鉴别VEGF与这些底物的联系。结果显示P/C复合物明显比其他类型的底物,包括Ⅰ型胶原纤维,或者明胶或者Ⅰ型胶原单体更易与VEGF-165结合。此外,与明胶和Ⅰ型胶原单体相比,Ⅰ型胶原纤维与VEGF-165的结合要多一些。8. VEGF-165与不同水凝胶的结合在PH=6.8和室温条件下,制备透明质酸-己二酸二酰肼(HA-ADH)是通过含有EDC和HOBt的环境下,HA与超过ADH 30倍分子量分子反应制成的。HA-乙醛(HA-CHO)的制备是通过HA与等分子的高碘酸钠反应制成的。反应通过加入乙二醇终止。产物用消耗性透析的方法纯化,低压冻干后储存在4℃。ELISA实验研究VEGF-165与水凝胶的结合。用BSA阻断后,HA水凝胶和“杂交”HA水凝胶与P/C复合物合成,与可溶性的VEGF-165培养在一起。结合的VEGF-165可以被生物素化的抗VEGF抗体和NeutrAvidinTM-HRP检测出来。水凝胶可以被NeutrAvidinTM-HRP和TMB发生反应产生的蓝色染出印记。照片显示,与VEGF-165进行了共培养的“杂交”HA水凝胶显示出蓝色深染。与VEGF-165进行了共培养的HA水凝胶显示出浅蓝色染色,而未经VEGF-165进行共培养的“杂交”HA水凝胶和HA水凝胶几乎看不到蓝色染色,PBS组染色阴性。9.复合水凝胶的制备和VEGF-165从不同水凝胶的释放本实验检测了VEGF-165与之结合的稳定性。在水凝胶制备中,VEGF-165加载在每一种水凝胶上,体外ELISA检测发现:直到第20天VEGF-165都能从“杂交”HA水凝胶上释放出来。基于在ELISA上做出的标准弯曲,我们计算出从水凝胶中释放的VEGF的比例。在HA水凝胶(HA)和合并P/C复合物的“杂交”HA水凝胶(HA+P/C)这两种水凝胶中,都能观察到早期爆发性的释放(0-3天)。在12天内,81±2%(16.2±0.4ng)的VEGF-165从HA水凝胶中释放出来。而只有42±3%(8.4±0.6ng)的VEGF-165从“杂交”HA水凝胶(HA+P/C)中释放出来。因此,甚至在20天后“杂交”HA水凝胶(HA+P/C)还保留了大约10ng(48.7±0.4%)它说明“杂交”HA水凝胶(HA+P/C)能提供比HA水凝胶(HA)更稳定的VEGF-165的储备。10. HA水凝胶中P/C复合物促进体外组织培养的主动脉血管发生把八周龄C57BL/6小鼠的主动脉环培养在HA水凝胶(HA)和合并P/C复合物的“杂交”HA水凝胶中。在组织培养中,加入培养基(EBM)之前,把用于植入主动脉环的水凝胶与VEGF-165共培养。没有加入VEGF-165的水凝胶,HA水凝胶和“杂交”HA水凝胶被作为对照。在主动脉环培养模型中可见VEGF-165刺激的血管生成。主动脉环在水凝胶中培养12天,用显微照相技术进行观察。VEGF-165处理组,HA水凝胶和“杂交”HA水凝胶中的主动脉环的断面上均可观察到微血管生成。根据计算机图像分析,“杂交”HA水凝胶(HA+P/C+VEGF)组中的微血管覆盖区域明显超过HA水凝胶组,是其血管生成的3倍。在无VEGF-165处理组,植入在HA水凝胶和“杂交”HA水凝胶上的主动脉环没有显示出明显的微血管生成,这说明在缺乏VEGF的条件下是对于血管生成的过程是不利的。11. Perlecan修饰的OPLA对BALB/c-Nu鼠血管生成的研究本实验采用由D,D-L,L聚乳酸形成的复合支架OPLA,这种支架具有多孔小平面结构,适合于高密度细胞悬液。利用Perlecan和基质胶与OPLA构建具有促血管发生功能的高分子组织工程支架。将此支架处理后植入BALB/c裸鼠体内,观察其促进血管形成的情况。通过大体观察和HE染色观察,我们发现,随时间延长,移植物周围血管逐渐增多,三周组最为明显,可以看到大量微细血管长入;同时,可以看到OPLA支架随时间延长逐渐降解,支架边缘与组织边界模糊。有大量血管长入OPLA中,尤其在第四周时,三种处理因素组的血管生成量最多,而且可以看到生成血管的管径增大,血管更为成熟。12. CD31在Perlecan修饰的OPLA促进血管生成中的表达通过CD31的免疫组化染色,发现各处理组随着时间的增加,其促进血管生成的量也增加,但变化趋势不完全相同,VEGF+OPLA组在2周时增速明显,比MM+OPLA组作用要强,但在第4周时,MM+OPLA组的血管密度要大于VEGF+OPLA组,这也就表明VEGF从OPLA中释放的高峰期要早于MM。无论在任何时间点,VEGF+MM+OPLA组的微血管密度都要显著的高于其他处理组,可以认为三者对于微血管生成具有协同作用。