压力超负荷引起的小鼠心肌翻译组异常及其机制研究研究背景心力衰竭是一种常见的复杂心脏疾病,患病率和致死致残率都很高,严重威胁人们的生命健康。在慢性压力超负荷或其他病理因素的作用下,心脏发生代偿性心肌肥厚,能维持正常甚至增强的收缩功能;然而,如果病理因素持续存在,心肌则进入失代偿期,心功能逐渐恶化,最终发生心力衰竭。因此,研究心肌从代偿向失代偿转变的分子机制,对理解心力衰竭的发病机制,发现潜在的心力衰竭治疗靶点都有重要意义。一直以来,对基因表达调控的研究主要集中于转录调控,对翻译调控在基因表达中作用的研究相对较少。已有证据表明,翻译调控在蛋白表达、细胞稳态以及细胞增殖、生长和分化等方面发挥关键作用,翻译异常与许多疾病的发生发展密切相关。有研究发现翻译调控在压力超负荷诱导的代偿性心肌肥厚及心力衰竭中发挥重要作用;然而,已有研究只揭示了压力超负荷引起的某些特定基因的翻译改变及其意义,缺乏对所有心肌基因翻译水平的改变及其整体特征（即翻译组）的研究。填补这一研究空白,有助于揭示压力超负荷对心肌蛋白翻译影响的全景,全面理解心肌失代偿的发生机制。基于RNA高通量测序的核糖体谱分析是最常用的翻译组学研究技术之一,能精确检测全基因组范围内基因的翻译水平。这一技术已经广泛用于肿瘤等领域的研究,发现肿瘤组织中不同基因簇的翻译及其调控的变化存在明显差别,并且这些差别与肿瘤的发生发展密切相关。该技术也为阐明压力超负荷对心肌蛋白翻译影响的全景提供了有力的工具,但迄今为止仍未见相关研究的报道。另外,真核起始因子2α（eukaryotic Initiation Factor2α,eIF2α）的磷酸化和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian Target Of Rapamycin,mTOR）信号通路是真核细胞翻译的关键调控机制,它们主要在翻译起始阶段发挥作用,影响基因的翻译效率,即每条mRNA产生蛋白质的速度。有研究表明,在压力超负荷心脏中,eIF2α磷酸化水平显著增加,mTOR信号通路明显激活。两者在压力超负荷诱导的心室重构和心力衰竭中都发挥重要而复杂的作用。基于上述认识,我们提出如下科学假说:即压力超负荷能显著改变心肌翻译组,特别是那些对维持心脏功能具有重要作用的基因的翻译水平,这些改变与持续压力超负荷引起的心肌失代偿及心力衰竭密切相关,而eIF2α磷酸化可能是上述改变的重要机制。为验证这一假说,我们利用核糖体谱分析技术研究了压力超负荷引起心肌失代偿及心力衰竭过程中,心肌翻译组的异常改变和机制。研究目的1、阐明压力超负荷引起的小鼠心肌翻译组的整体改变及其特征。2、揭示翻译组异常与压力超负荷引起的小鼠心肌失代偿和心力衰竭的关系及其机制。研究方法1.动物分组将C57BL/6小鼠随机分为假手术（Sham）组和主动脉弓缩窄（Transverse Aortic Constriction,TAC）组,其中TAC组进一步分为TAC术后2周组（TAC-2W）、TAC术后 5 周组（TAC-5W）、TAC-5W+表达绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein,GFP）的腺相关病毒（Adeno-Associated Viruses,AAV）组（AAV-GFP）、TAC-5W+表达eIF2α磷酸化缺陷突变体的腺相关病毒组（AAV-eIF2α-S51A）。2.建立动物模型参照文献报道中无需开胸的TAC方法建立小鼠心脏压力超负荷模型。3.超声心动图及颈动脉多普勒超声检查在异氟烷全麻下,利用高分辨小动物超声系统进行心脏超声和颈动脉多普勒超声检查,评估心脏功能。4.病毒转染于TAC术前一周,小鼠尾静脉注射eIF2α-S51A病毒和GFP对照病毒,并在一周后检查转染效率。5.样品收集和处理收集Sham组、TAC术后第2周和第5周组小鼠左心室的组织样本,一部分样本保存在-80℃,另一部分保存在4%多聚甲醛溶液中,用于后续实验。6.核糖体谱分析裂解左心室组织,离心后保留上清,加入核糖核酸酶Ⅰ（RibonucleaseⅠ,RNaseⅠ）酶解处理,然后进行蔗糖密度梯度超速离心,分离核糖体,并提取与核糖体结合的RNA（即核糖体印迹）,然后进行高通量RNA测序和数据分析,比较各组小鼠心肌翻译组的改变。7.分离小鼠左室心肌细胞利用Langendorff灌注系统和胶原酶Ⅱ分离各组小鼠的左心室心肌细胞。8.分离多聚核糖体参照文献报道的方法从左心室组织中分离多聚核糖体,并提取与之结合的RNA。9.蛋白质免疫印迹（Western blotting）用裂解液提取总蛋白并定量,然后电泳分离蛋白样品,用电转法将分离的蛋白转移到聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene Fluoride,PVDF）膜,经脱脂牛奶封闭后与一抗4℃孵育过夜,随后在室温孵育二抗,最后用化学发光液和成像系统使蛋白条带显影。10.免疫组织化学用3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶后,微波加热修复抗原,经山羊血清封闭后与一抗4℃孵育过夜,随后室温孵育二抗,目的蛋白显色后用显微镜观察、拍摄。11.定量聚合酶链式反应参照TaqMan法PCR试剂盒提供的方法进行反转录和定量聚合酶链式反应（quantitative PCR,qPCR）。12.脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记染色参照试剂盒提供的方法进行脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记（TdT-mediated dUTP nick labeling,TUNEL）染色,检测左心室组织的细胞凋亡。13.数据处理和统计分析利用DAVID等多种生物信息学工具进行基因功能注释和功能富集分析。用Shapiro-Wilk检验进行数据正态性检验。双尾t检验和单因素方差分析分别用于比较两组和多组正态分布数据的差异。P值＜0.05认为有统计学意义。研究结果1.成功建立了心脏压力超负荷小鼠模型心脏超声和多普勒超声检查结果表明与Sham组相比,TAC组小鼠主动脉弓明显缩窄,右颈动脉的血流流速显著增加,而左颈动脉的血流流速明显减少。这些结果表明TAC引起了心脏压力超负荷,动物模型成功建立。2.TAC能引起小鼠心肌从代偿性肥厚到功能失代偿心脏超声检查结果表明与Sham组相比,TAC-2W组小鼠的舒张末期室间隔厚度（Interventricular Septal end diastole,IVSd）和舒张末期左室后壁厚度（Left Ventricular Posterior Wall end diastole,LVPWd）明显增加,而舒张末期左室内径（Left Ventricular Internal Diameter end diastole,LVIDd）、左室短轴缩短率（Fractional Shortening,FS）和左室射血分数（Ejection Fraction,EF）则没有显著改变;而在TAC术后5周,小鼠EF和FS显著下降了约50%,同时左心室内径明显扩大。这些结果表明在TAC术后2周,压力超负荷主要引起小鼠心肌代偿性肥厚,而在压力超负荷的持续作用下,TAC术后5周小鼠心肌发生了功能失代偿。3.慢性压力超负荷引起心肌翻译组显著改变,失代偿期心肌基因的翻译效率明显下降各组数据整合分析的结果表明在Sham组、TAC-2W组和TAC-5W组心肌中都检测到的转录本共2537个。与Sham组相比,TAC-2W组和TAC-5W组小鼠这2537个基因的翻译效率都明显改变:TAC术后2周时,这些基因的平均翻译效率显著增加。但这种变化在TAC术后5周时被逆转。与TAC-2W组相比,TAC-5W组共有4346个转录本的翻译效率明显下调,而且这4346个转录本上的核糖体密度的分布频数也明显下降。4.心肌失代偿过程中翻译效率显著下调的基因在心脏功能调控中有重要作用上述4346个在心肌失代偿过程中翻译效率显著下调基因的功能富集分析表明,它们主要涉及维持正常心脏功能的重要生物过程或者信号通路,包括能量代谢、心肌结构和功能、血管发育及血管生成。对这些基因中关键节点分子的验证结果进一步表明,与TAC-2W组相比,包括血管内皮生长因子受体1（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 1,FLT1）、血管内皮生成因子 A（Vascular Endothelial Growth Factor A,VEGFA）在内的8个促血管生成基因、以及能量代谢基因苹果酸脱氢酶2（Malate Dehydrogenase 2,MDH2）和细胞色素c氧化酶15（Cytochrome C Oxidase Assembly Homolog COX15,COX15）、肌肉特异基因GATA 结合蛋白 4（GATABinding Protein4,GATA4）和结蛋白（Desmin）在 TAC-5W组的翻译效率都显著降低。5.没有证据表明压力超负荷引起翻译延长过程的终止为验证压力超负荷对翻译延长过程的影响,我们分析了 Sham组、TAC-2W组、TAC-5W组的核糖体印迹数据,比较了核糖体印迹在所有转录本的开放阅读框末端区域、以及在5个血管生成相关基因上的位置分布和平均丰度。结果表明,核糖体印迹在转录本上的位置分布没有明显的聚集和偏好,提示压力超负荷可能并不引起翻译延长过程的终止。6.在心肌失代偿过程中蛋白翻译的调控机制明显异常Western blotting结果显示,与Sham组相比,TAC-2W组中mTOR及其下游靶分子4E结合蛋白（4E Binding Protein,4EBP）和核糖体S6蛋白激酶（p70S6 Kinase,p70S6K）的磷酸化水平显著增加。而与TAC-2W组相比,TAC-5W组中mTOR、4EBP以及p70S6K的磷酸化水平则明显下降。eIF2α的磷酸化水平在TAC-2W组只有轻微增加,但在TAC-5W组则显著升高。7.抑制eIF2α磷酸化能明显改善TAC小鼠的心脏功能转染eIF2α-S51A病毒抑制eIF2α磷酸化,能明显改善TAC术后5周小鼠的心脏功能,提高重要心肌基因（FLT1、MDH2、COX15、GATA4、Desmin和VEGFA）的翻译效率,增加心脏微血管的密度,并减少心肌细胞的凋亡。结论1、压力超负荷能明显改变小鼠心肌基因的翻译组:在代偿期显著增加翻译效率,但在失代偿期翻译效率则明显下降,其中包括很多具有重要功能的心肌基因。2、压力超负荷能持续激活eIF2α。抑制eIF2α磷酸化能明显改善TAC小鼠的心脏功能、提高重要心肌基因的翻译效率、增加血管生成和减少心肌细胞凋亡。活性氧引起的内皮细胞miRNA线粒体分布的动态变化及其机制研究研究背景近年来,心血管疾病的发病率和死亡率一直居高不下,造成了巨大的社会和经济损失,已成为全球重大的公共卫生问题。大量研究已经证明血管内皮损伤是各种心血管疾病发生发展的关键始动因素和核心机制之一,而活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）则是导致血管内皮损伤的重要因素。然而,ROS损伤血管内皮的机制非常复杂,迄今仍未完全阐明。因此,揭示ROS引起内皮损伤的病理机制对于理解心血管疾病的发病机制,开发有效的防治方法都至关重要。MicroRNAs（miRNAs）是一类具有调控功能的非编码小RNA,在内皮细胞稳态和ROS导致的内皮细胞损伤中都发挥重要作用。MiRNAs广泛分布在细胞浆和各亚细胞器中,如细胞核、核仁、内质网、线粒体等。MiRNAs的这种区域化分布在维持细胞稳态中发挥重要作用。特别是那些分布在线粒体的miRNAs,它们种类和丰度的变化与正常生理功能调控,以及多种疾病特别是心血管疾病的发生发展密切相关。例如miR-378在心肌细胞线粒体的再分布能促进糖尿病心肌病的发展。然而,在ROS诱导内皮细胞损伤时,miRNA线粒体分布的动态变化特征及其功能意义目前仍缺少系统性研究。大量研究已经表明线粒体中的miRNAs绝大多数都由细胞核基因组编码,在胞浆成熟后转运到线粒体。阐明miRNA的线粒体转运机制是充分理解miRNA线粒体分布的变化特征及其病理生理意义的关键环节。然而,目前关于miRNA线粒体转运机制的研究还很少,仍有很多问题亟待阐明。近期Shepherd等人发现多核苷酸磷酸化酶（Polynucleotide Phosphorylase,PNPASE）能参与心肌细胞miR-378的线粒体转运。考虑到线粒体miRNA及其运输系统的复杂性,显然还有PNPASE之外的许多未知蛋白参与并调控miRNA的线粒体转运。因此,我们这部分工作的主要内容是探究在ROS诱导内皮损伤过程中,miRNA线粒体分布的动态变化及其功能意义,并初步揭示miRNA线粒体转运的机制。研究目的1、揭示ROS诱导内皮损伤过程中,内皮细胞miRNA线粒体分布的动态变化特征及其功能意义。2、初步发现miRNA线粒体转运的机制,以及ROS对这一机制的影响,即ROS引起内皮细胞miRNA线粒体分布改变的机制。研究方法1.细胞培养、处理和转染用完全内皮细胞培养基培养人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs）,用 H2O2或葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase,GO）刺激,建立ROS诱导的内皮细胞损伤模型。用Lipofectamine RNAiMAX或Lipofectamine 3000进行细胞转染。2.亚细胞分离参照文献报道的方法分离纯化HUVECs的胞浆和线粒体。3.qPCR参照试剂盒提供的方法进行qPCR。利用合成的单链寡核苷酸生成标准曲线进行绝对定量qPCR。4.miRNA测序和数据分析利用Hiseq SE50对整个内皮细胞和内皮细胞线粒体进行miRNA测序,之后进行数据分析,获得miRNA表达矩阵,然后进行miRNA靶基因预测、功能富集和调控网络等生物信息学分析。5.蛋白质免疫印迹（Western blotting）用裂解液提取总蛋白并定量后,凝胶电泳分离蛋白质样品,用电转法将分离的蛋白转移到PVDF膜,经5%脱脂牛奶封闭后与一抗4℃孵育过夜,随后室温孵育二抗,最后用化学发光液和成像系统使蛋白条带显影。6.免疫沉淀将内皮细胞线粒体的裂解产物相继与抗体和Protein A/G琼脂糖珠子孵育,离心后保留琼脂糖珠子,用蛋白上样缓冲液重悬并煮沸,再次离心后收集上清,随后进行蛋白免疫印迹,检测相应蛋白的表达。7.线粒体染色和免疫荧光染色用MitoTracker标记线粒体,然后固定细胞并破膜,随后相继与一抗和荧光标记的二抗孵育,细胞核染色后在激光共聚焦显微镜下观察和拍摄。8.RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）利用相应的抗体和Millipore的RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒进行RIP。9.Pull down 实验参照文献报道的方法进行生物素化的miR-301a-3p pull-down实验。10.非标记的定量蛋白组学分析参照文献报道的方案进行非标记的定量蛋白组学分析。11.生物膜干涉分析（BLI）将生物素标记的RNA寡核苷酸结合到链霉亲和素修饰的生物传感器,然后与不同浓度的蛋白样品孵育,检测二者的结合动力学。12.Annexin V/Propidium iodide 染色和 EdU 染色参照Annexin V/Propidium iodide凋亡试剂盒和EdU染色试剂盒提供的方法,分别检测内皮细胞的凋亡和增殖。13.MTT检测参照MTT试剂盒提供的方法,检测不同浓度GO对内皮细胞活力的影响。14.荧光素酶实验将含野生或突变的靶基因中miRNA结合位点序列的DNA片段克隆到双荧光素酶表达载体,然后将构建好的载体和miRNA模拟物或对照寡核苷酸共转染HEK293T细胞,72小时后检测各组的荧光素酶活性。15.统计学分析用Shapiro-Wilk检验进行数据正态性检验。Wilcoxon秩和检验用于非正态分布数据的两组比较。双尾t检验和单因素方差分析分别用于正态分布数据的两组和多组间差异比较。P＜0.05认为有统计学意义。研究结果1.ROS能诱导内皮细胞损伤H2O2能显著诱导内皮细胞凋亡,抑制细胞增殖。同时,GO也能浓度依赖性的诱导内皮细胞损伤。2.ROS能显著减少多种miRNAs在内皮细胞线粒体中的含量,但不影响它们在整个细胞中的表达miRNA测序结果表明,H2O2能显著降低数十种miRNAs在HUVECs线粒体中的含量,但不影响其在整个细胞中的表达。其中,miR-301a-3p和miR-381-3p是变化最显著的高丰度miRNA之二。qPCR和绝对定量PCR的结果也进一步证实了 miRNA测序的结果。3.线粒体分布显著减少的miRNAs与ROS引起的内皮损伤关系密切功能富集分析表明,上述线粒体分布显著减少但细胞总表达量不变的miRNAs显著富集在多个与ROS致内皮损伤作用相关的生物过程和信号通路。其中miR-381-3p是这些miRNAs潜在细胞凋亡和增殖调控网络的关键节点分子之一。4.MiR-381-3p通过核因子I/A和低密度脂蛋白受体相关蛋白6及其下游分子促进H2O2诱导的内皮细胞凋亡和增殖抑制为揭示ROS引起的内皮细胞miRNA线粒体分布改变的功能意义,我们深入研究了 miR-381-3p在H2O2诱导的内皮损伤中的作用及其机制。Western blotting、qPCR和荧光素酶实验结果都表明miR-381-3p能直接靶向核因子I/A（Nuclear FactorIA,NFIA）和低密度脂蛋白受体相关蛋白 6（LDLReceptor Related Protein 6,LRP6）,抑制它们在内皮细胞的表达。进一步的功能研究结果表明miR-381-3p能通过靶向NFIA和LRP6及其下游分子（P53、P21、MYC、细胞周期蛋白D1）促进H2O2诱导的内皮损伤。5.在线粒体中含量丰富的Musashi RNA结合蛋白2能与miR-301a-3p和miR-381-3p特异结合,促进miR-301a-3p和miR-381-3p在线粒体的分布为揭示miRNA线粒体分布的机制,发现参与miRNA线粒体转运的蛋白,我们利用内皮细胞线粒体中高丰度的miR-301a-3p进行了 miRNA pull-down和非标记的定量蛋白组学分析。结果表明,Musashi RNA结合蛋白2（Musashi RNA Binding Protein2,MSI2）在生物素化 miR-301a-3p 的 pull-down 产物中丰度最高,而且MSI2也能与内源性miR-301a-3p和miR-381-3p特异结合。另外,在多种细胞的线粒体中MSI2都含量丰富。抑制内皮细胞MSI2的表达,能显著减少miR-301a-3p和miR-381-3p在线粒体中的丰度,同时增加其在胞浆的丰度。我们还发现,MSI2 与 Argonaute2 蛋白（Argonaute2,Ago2）在 HUVEC 线粒体中并没有相互作用。这些结果表明MSI2能促进内皮细胞miR-301a-3p和miR-381-3p的线粒体转运,而且这一作用可能并不依赖于Ago2蛋白。6.氧化应激能显著下调MSI2的表达H2O2和GO都能显著降低HUVECs中MSI2的表达,同时促进MS12在胞浆和线粒体间的再分布,即使MS12在线粒体中的含量减少,但在胞浆中的含量增加。有研究表明 Krüppel 样因子 4（Krüppel-Like Factor4,KLF4）能调控 MSI2表达,但我们发现KLF4与H2O2对MSI2的调控无关。结论1、活性氧导致内皮细胞损伤时,能显著减少miR-301a-3p和miR-381-3p等多种miRNAs在线粒体中的含量,但对它们在整个细胞中的表达没有明显影响。而且,这些miRNAs与ROS诱导的内皮损伤关系密切。2、线粒体分布显著减少的miR-381-3p能通过靶基因NFIA和LRP6及其下游分子（P53、P21、MYC、细胞周期蛋白D1）促进H2O2诱导的内皮细胞凋亡和增殖抑制。3、MSI2能特异结合miR-301a-3p和miR-381-3p并促进其在内皮细胞线粒体的分布,可能是miRNA线粒体转运系统的重要组分。