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水通道蛋白(Aquanproins,AQPs)是膜水通道蛋白家族、为调节跨细胞水平衡的选择性孔道,迄今在哺乳动物中已发现13种水通道蛋白(0～12),它们由一系列具有同源性的内在膜蛋白家族成员组成,大多数选择性地分布在那些与体液吸收与分泌有关的上皮细胞及可能协同跨细胞转运的内皮细胞中。对人类AQP基因突变和应用AQP基因敲除鼠进行的大量研究表明水通道蛋白在体内液体转运生理中发挥重要作用。目前的研究已经发现人和小鼠的胎盘胎膜中均有水通道蛋白3 (AQP3)、水通道蛋白8 (AQP8)的表达,提示AQP3、AQP8可能在妊娠生理中发挥关键作用。本实验应用AQP3基因敲除鼠和AQP8基因敲除鼠研究妊娠过程中表型变化,以寻找AQP3、AQP8在妊娠、胎儿生长发育及母胎液体平衡中发挥作用的直接证据。第一部分AQP3基因敲除鼠妊娠相关表型的研究【研究目的】研究水通道3(aquaporin 3,AQP3)在昆明鼠胎盘、胎膜组织的表达及分布情况,应用AQP3基因敲除鼠与昆明鼠对妊娠过程中相关表型进行分析,以便寻找AQP3在妊娠、胎儿生长发育及母胎液体平衡中发挥作用的直接证据。【材料方法】本研究以纯合子AQP3基因敲除鼠(AQP3-KO鼠)为实验组,相同遗传背景的昆明鼠为对照组。纯合子AQP3基因敲除小鼠按雌雄2:1的比列合笼交配,相同条件下进行昆明鼠合笼交配,检出阴道栓当日记为妊娠第一日(1 days postcoitum,1dpc)。1.每日进行合笼交配的纯合子AQP3基因敲除鼠及昆明鼠(Kunming)各7笼,每天分别记录AQP3基因敲除鼠及昆明鼠受孕数,将两组鼠按孕龄(孕7天、13天、16天、18天、足月分娩)分为五个小组,2.取孕13天成年健康昆明小鼠的胎盘胎膜组织各3例,运用逆转录-聚合酶链反应( RT-PCR)技术检测昆明鼠胎盘胎膜组织中水通道蛋白-3 mRNA的表达。3.取昆明小鼠和AQP3基因敲除鼠孕13天的胎盘固定于4%多聚甲醛后行HE染色及免疫组化,检测胎盘结构形态变化及AQP3在胎盘胎膜组织中的表达定位。4.分别记录每小组总胚胎总数及异常萎缩胚胎数;记录各组孕13天,孕16天,孕18天的胎鼠重量,胎盘湿重,胎盘干重,胎盘面积,胎盘含水量以及羊水量,并取孕16的羊水样本测量离子成分及渗透压。5.统计学方法:单因素方差分析及卡方检验用来做统计学检测。【结果】1.本研究运用RT-PCR技术证实AQP3mRNA在昆明孕鼠胎盘、胎膜组织均有表达;运用免疫组织化学技术对孕鼠胎盘和胎膜组织中的AQP3表达以及表达定位进行研究,发现在胎盘样本中AQP3在胎盘滋养细胞有定位表达,在胎膜中AQP3在羊膜上皮细胞表达。2.与相同遗传背景的昆明鼠相比,AQP3基因缺失后妊娠相关表型变化如下:(1)AQP3敲除鼠受孕率明显降低,孕早期(孕7天)AQP3基因敲除鼠的孕囊数目明显少于昆明鼠(P=0.001)。随着妊娠天数的延长,AQP3基因敲除鼠与昆明鼠孕囊数均有下降,但胚胎丢失率未见明显差异。(2)AQP3基因敲除鼠胎鼠在妊娠16天、18天及新生鼠的体重较相同孕天昆明鼠明显降低(P=0.000;0.000;0.000);(3)孕13天及孕16天AQP3基因敲除鼠的胎盘湿量和胎盘含水量均大于相同孕天昆明鼠的胎盘湿量和胎盘含水量。(4)AQP3基因敲除鼠的羊水量在孕16、18天时较昆明鼠明显减少,且孕16天羊水中尿素,Ka+, Na+水平升高,表现为渗透压升高。(5)胎盘HE染色:昆明鼠胎盘HE染色三层结构层次清楚,从母体蜕膜侧至胎儿侧依次为巨细胞滋养细胞层、海绵样滋养层及迷路样滋养层,而AQP3基因敲除鼠三层结构层次不清,海绵样滋养层的生长失去控制,成块生长并向迷路样滋养层侵入,使得迷路样滋养层细胞排列紊乱。【结论】1.昆明孕鼠胎盘、胎膜组织均有AQP3在mRNA和蛋白水平的表达;2. AQP3基因敲除鼠妊娠相关表型发生变化;3. AQP3缺失后可导致受孕率显著减少,孕晚期羊水量减少,羊水渗透压增高,胎鼠体重减低,及胎盘结构改变;4.本研究为水通道蛋白3在妊娠、胎儿生长发育及母胎液体平衡中发挥关键作用提供直接证据。第二部分AQP8基因敲除鼠妊娠相关表型的研究【研究目的】研究水通道8(aquaporin 8,AQP8)在C57鼠胎盘、胎膜组织的表达及分布情况,应用AQP8基因敲除鼠与C57鼠对妊娠过程中相关表型进行分析,以便寻找AQP8在妊娠、胎儿生长发育及母胎液体平衡中的直接证据。【材料与方法】本研究以纯合子AQP8基因敲除鼠(AQP8-KO鼠)为实验组,相同遗传背景的C57鼠为对照组。妊娠天数算法、实验方法及统计学方法同第一部分。【结果】:1.本研究运用RT-PCR技术证实AQP8mRNA在C57孕鼠胎盘、胎膜组织均有表达;运用免疫组织化学技术对C57孕鼠胎盘和胎膜组织中的AQP8表达以及表达定位进行研究,发现在胎盘样本中AQP8在胎盘滋养细胞和羊膜上皮细胞有定位表达。2.与相同遗传背景的C57鼠相比,AQP8基因缺失后妊娠相关表型变化如下:(1)AQP8基因敲除鼠胎鼠在妊娠16天、18天及新生鼠的体重明显重于C57鼠胎鼠及新生鼠(P=0.001;0.000;0.000);(2)孕16、18天AQP8基因敲除鼠的胎盘湿重及胎盘含水量较相同孕天C57鼠增加。(3)孕13、16、18天AQP8基因敲除鼠的羊水量较C57鼠明显增多,且孕16天羊水中尿素,Ka+,Na+,Cl-浓度升高,羊水渗透压增高。(4)胎盘HE染色:与C57鼠胎盘HE染色相比,AQP8基因敲除鼠胎盘镜下结构未见明显异常改变。【结论】1. C57孕鼠胎盘、胎膜组织均有AQP8在mRNA和蛋白水平的表达;2. AQP8基因敲除孕鼠妊娠相关表型发生改变3. AQP8缺失可导致羊水增多,羊水渗透压升高,胎鼠重量增加,胎盘湿重增加。4.本研究为水通道蛋白8在妊娠、胎儿生长发育及母胎液体平衡中发挥关键作用提供直接证据。