银杏内生真菌抗菌、抑菌活性的初步研究

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内生真菌是一种能在植物的健康组织中生存的特殊真菌,具备一定的药用价值,由于需要独特的环境条件,研究相对较少。一般从树龄较长或者有地理特征的植株中都能筛选到新内生菌,从而为研发具备生物活性物质提供条件。银杏是珍稀植物,因组织中含银杏黄酮、内酯、生物碱等成分,具有抗菌和抗氧化活性。根据内共生理论,银杏组织是挖掘新型具有抑菌活性内生真菌的一个重要来源。本研究采用组织分离法从健康银杏组织中分离出30株具有抑菌、抗菌活性的内生真菌,从中选出10株抑菌活性较高且稳定的菌株对其抑菌活性进行复筛,为获得优良菌株提供进一步参考。通过平板孔阱扩散法进行复筛,获得了一株抑菌活性较高且菌种特性稳定的Y09菌株。通过形态学和分子生物学相结合的方法对菌株Y09进行鉴定,采用CTAB法提取DNA,并对PCR扩增得到的序列进行分析。结果表明,该菌株与草酸青霉的rDNA序列的同源性高达99%,初步确定该菌株为草酸青霉,并将其命名为Penicillium oxalicum SPE009。通过单因素实验法确定了菌株SPE009在装液量30mL/100mL、接种量5%、温度26℃、转速160r/min、发酵初始pH为7的条件下,所测菌种的发酵产物对黑曲霉有较高的抗菌活性。与此同时我们还进一步探讨了营养因素对菌株活性的影响。根据PB实验选取对抗菌活性有显著影响的三个因素:发酵初始pH值、葡萄糖含量、培养温度。通过响应面优化法对其进行优化,得到三个条件的最佳组合:初始pH为6.97、葡萄糖含量为19.55g/L、培养温度为26.31℃,在此条件下,菌株的抑菌圈理论值为20.10mm。将SPE009菌株的代谢产物处理后,经薄层色谱法和硅胶柱色谱法分离纯化,得到的样品中3号抗菌活性最高,其抑菌圈直径为19.9mm。该样品经C-18反相柱及薄层点样合并制得3-1组分,并进行抗菌性能测定,其活性高达20.0mm。利用HPLC和LC-MS法对组分3-1进行分析,确定该组分中含有分子式为C20H2209的物质,通过与天然产物数据库比对得知,该抗菌活性物质为毛果杨苷。
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