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原始生殖细胞（Primordial Germ Cells,PGCs）是生殖细胞的祖细胞,在生命延续的过程中至关重要。研究PGCs发生不仅对于了解精卵发生的机制具有意义,而且对理解人和动物的生殖生育过程也有参考价值。禽类PGCs具有独特的迁移路径,能够为禽类遗传工程改造、体细胞重编程和珍禽种质资源保护提供有效的工具细胞。然而从鸡胚分离获得的PGCs数量较少,体外培养诱导的数量目前也不能满足研究和生产的需要,关键问题是对PGCs的发生发育调控机制仍然不清楚,影响其发生的关键调控因子尚未找到,因此亟需深入探析PGCs发生过程中的调控因素。PGCs的发生是一个复杂且精密的调控过程,受多种因素影响。目前,研究者们已发现一些基因、信号通路、生长因子和表观遗传修饰因素对PGCs的发生起重要调控作用,但体外诱导PGCs生成的效率仍未达到预期要求,因此,亟需从新的领域对PGCs的生成机制进行创新性探究。随着测序技术和生物信息分析技术的发展,长链非编码RNA（longnon-coding RNA,lncRNA）在生命活动过程中的作用逐渐受到重视,研究也证实其在生殖细胞分化过程扮演重要角色,但功能和机制尚未见报道。为此,本研究基于课题组前期对鸡ESCs（Embryonic Stem Cells,ESCs）、PGCs转录组高通量测序结果,筛选出仅在PGCs中特异高表达的lncRNA（TCONS008741 70）,其靶向骨形成蛋白4基因（Bone Morphogenetic Protein4,BMP4）,因此命名为lncRNA-BMP4。本研究以调控PGCs形成的关键lncRNA-BMP4为切入点,对该lncRNA如何调控靶基因BMP4从而促进PGCs形成的机制进行详细探究。为揭示早期鸡PGCs发生过程中关键影响因素的作用及机制,完善PGCs发育的调控网络,进一步提高PGCs诱导效率,推广PGCs应用提供理论依据。研究结果如下:（1）lncRNA-BMP4筛选、克隆及生物信息学分析 对鸡ESCs、PGCs进行转录组测序分析,发现了 lncRNA（TCONS00874170）在PGCs中特异高表达,且预测该lncRNA靶向BMP4,故命名为lncRNA-BMP4;Northern Blot检测结果显示lncRNA-BMP4在细胞中存在;同时,克隆lncRNA-BMP4转录本全长1244 bp;qRT-PCR检测结果显示lncRNA-BMP4在三种细胞中表达模式（ESCs:1;PGCs:3.738±0.237;SSCs:0.323±0.087）与测序结果一致,表达谱检测也发现lncRNA-BMP4在生殖嵴中高表达;核质分离结果显示,lncRNA-BMP4在细胞核、质中均有分布,但其在细胞核中的（4.952±0.251）分布量高于细胞质（2.808±0.083.P<0.01）;生物信息学预测发现lncRNA-BMP4具有231 bp的ORF,构建的ORF原核融合表达载体,可在体外BL大肠杆菌中诱导表达,Western Blot检测结果显示,lncRNA-BMP4可编码一个12.4kD的小肽。（2）体内、外验证lncRNA-BMP4在PGCs形成过程的功能 分别构建了lncRNA-BMP4过表达载体 oelncRNA-BMP4和干扰载体shlnc4-1、shlncRNA-BMP4-2和shlncRNA-BMP4-3,干扰载体转染DF-1比较其活性。结果显示,shlncRNA-BMP4-2载体的干扰效果最好（0.349±0.028,P<0.01）,用于后续实验研究。分别在体外和体内验证lncRNA-BMP4在鸡PGCs形成过程中的功能,在体外试验中,形态学结果显示,过表达组第4d出现大量聚团类胚体,第6d数量达到峰值,干扰组仅在第6d出现少量类胚体;qRT-PCR检测发现,第6 d 时过表达组 Cvh（39.733±3.003）、C-kit（29.687±2.107）和 BMP4（24.687±2.936）极显著上升（P<0.01）,干扰组 Cvh（10.951±1.637）和BMP4（24.687±2.936）极显著下降（P<0.01）,C-kit（13.874± 1.783）显著下降（P<0.05）;流式细胞分析结果显示过表达组CVH阳性细胞率极显著升高（27.793%±1.942,P<0.01）,干扰后出现相反结果（4.196%±0.843,P<0.01）;间接免疫荧光结果与流式结果一致。在体内试验中,过表达组第4.5d时Cvh（2.986±0.146）、C-kit（2.374±0.276）和BMP4（2.637±0.228）表达量极显著上升（P<0.01）,干扰组Cvh（0.344±0.020）和 BMP4（0.436±0.029）显著下降（P<0.05）、C-kit（0.285±0.036）极显著下降（P<0.01）;流式细胞分析结果显示,过表达lncRNA-BMP4后,CVH 阳性细胞率极显著升高（25.103%±1.825,P<0.01）,而干扰后出现相反结果（2.861%±0.849,P<0.01）;免疫组化结果与流式结果一致。体外和体内功能验证结果均证明lncRNA-BMP4能够促进鸡PGCs形成。（3）探究调控lncRNA-BMP4差异表达的元件 扩增了lncRNA-BMP4启动子全长1270 bp,并构建重组载体plncBMP4-N1,瞬时转染DF-1后有绿色荧光,说明扩增的启动子有启动活性;进一步通过逐段截短法成功克隆lncRNA-BMP4的启动子系列缺失片段,分别连入 pGL3-basic 构建了pGL3-1270、pGL3-1086、pGL3-929、pGL3-832、pGL3-651、pGL3-473、pGL3-310、pGL3-148不同大小的重组载体,通过双荧光素酶报告系统检测确定-832～-651 bp是lncRNA-BMP4启动子活性核心区域。生物信息学预测到该启动子活性区域存在SOX17、CREB1、STAT1转录因子结合位点。据此,分别构建缺失三个结合位点的双荧光素酶报告重组载体,转染DF-1后,Cis调控检测发现只有缺失STAT1结合位点才能极显著降低lncRNA-BMP4启动子活性（5.333±0.418,P<0.01）;接着分别构建了Stat1干扰载体shStat1-1、shStat1-2、shStat1-3,转染DF-1比较活性,qRT-PCR检测结果显示shStat1-1干扰效果最好（0.368±0.02,P<0.01）,可用于后续实验。Trans调控检测发现干扰Stat1能极显著降低lncRNA-BMP4启动子活性（10.847±1.001,P<0.01）。以上结果均显示Stat1可正向调控lncRNA-BMP4启动子活性。在DF-1中转染启动子活性核心区域重组载体的基础上分别添加DNA甲基化抑制剂5’Azacd和组蛋白去乙酰化抑制剂TSA,双荧光素酶报告系统检测结果显示,lncRNA-BMP4启动子活性不受DNA甲基化影响,但与对照组（17.283±1.028）相比,添加TSA极显著提高lncRNA-BMP4启动子活性（37.183±1.176,P<0.01）。结果说明,转录因子STAT1和组蛋白乙酰化均能激活lncRNA-BMP4启动活性,而DNA甲基化对其启动活性无影响。（4）N6-甲基腺嘌呤（m6A）剂量依赖性影响lncRNA-BMP4作为海绵参与ceRNA的研究 生物信息学预测鸡上仅有miRNA-122mR11、miNA-12258与lncRNA-BMP4、BMP4具有共同结合序列。故首先验证这两个miRNA是否参与PGCs形成过程,分别构建了miRNA-12211和miRNA-12258过表达和干扰载体,体外形态学观察结果显示,过表达miRNA-12211后第2d、4d均未出现类胚体,仅第6d出现少量类胚体,反之,干扰后第4d就出现了大量聚团的类胚体,且第6d数量达到高峰。qRT-PCR检测结果显示过表达miRNA-12211后Cvh（5.837±1.002）、C-kit（5.844±1.004）、BMP4（5.394±0.420）和lncRNA-BMP4（3.063±0.055）均极显著下降（P<0.01）,而干扰组 Cvh（18.935±1.071）显著上升（P<0.05）,C-kit（18.247±1.096）、BMP4（17.880±1.203）和lncRNA-BMP4（12.981±0.972）均极显著上升（P<0.01）;流式分析结果显示过表达miRNA-12211极显著降低CVH阳性细胞率（19.703%±0.981,P<0.01）,干扰组极显著提高CVH阳性细胞率（30.952%±1.252,P<0.01）,且间接免疫荧光结果与流式结果一致。以上结果表明,miRNA-12211与lncRNA-BMP4的功能相反,能够抑制鸡PGCs形成,且抑制BMP4与lncRNA-BMP4的表达。但无论过表达还是干扰miRNA-12258均与对照组无显著差异,证明miRNA-12258对PGCs的形成无影响。因此选择miRNA-12211进一步验证其与lncRNA-BMP4、BMP4之间的关系,构建了 BMP43’UTR的荧光素酶报告载体,与miRNA-12211过表达载体共转染DF-1,荧光素酶报告系统检测BMP4 3’UTR的活性极显著降低（33097.67±3691.37,P<0.01）,在此基础上过表达lncRNA-BMP4能极显著拯救 BMP4 3’UTR 的活性（50612.10±3939.78,P<0.01）,结果说明lncRNA-BMP4能和miRNA-12211竞争结合BMP4 3’UTR,拯救BMP4的表达。分析lncRNA-BMP4的序列,发现存在16个m6A发生位点（RRACH）,通过RIP检测到在ESCs和PGCs中,m6A均能富集在lncRNA-BMP4上。为了检测m6A对lncRNA-BMP4结合miRNA-12211的影响,本研究分别构建了 m6A甲基转移酶Mettl3和Mettl14的干扰载体,转染DF-1检测活性,qRT-PCR检测shMettl3-1（0.483±0.012,P<0.01）和shMettl14-3（0.355±0.049,P<0.01）干扰效果最好,可用于后续实验。在过表达lncRNA-BMP4的基础上分别转染shMettl3-1和shMett114-3,或分别添加m6A激活剂MA、m6A抑制剂 NPC,qRT-PCR结果显示m6A水平的改变不影响lncRNA-BMP4的转录;接下来构建了Luc-lncRNA-BMP4荧光素酶报告载体,与oemiRN4-12211共转染DF-1,其荧光活性极显著下降（P<0.01）,在此基础上分别转染shMettl3-1和shMettl14-3,或添加NPC,Luc-lncRNA-BMP4的荧光活性显著上升（P<0.05）,而添加MA后荧光活性再次显著下降（P<0.05）,说明高m6A水平能促进lncRNA-BMP4结合miRNA-12211。为了进一步探究m6A影响lncRNA-BMP4结合的模式,分别针对16个m6A的发生位点进行递进累加突变,构建了 16个lncRNA-BMP4荧光素酶重组载体,RIP结果显示递进累加突变至6、7、8位点时,lncRNA-BMP4上m6A的富集水平出现极显著递减（P<0.01）,荧光素酶报告系统检测Luc-lncRN4-BMP4荧光活性出现极显著递增（P<0.01）。以上结果证明在lncRNA-BMP4吸附miRNA-12211,拯救BMP4表达的过程中,对m6A修饰位点数具有剂量依赖性。（5）m6A影响lncRNA-BMP4编码蛋白促进PGCs形成的研究 前期已证实lncRNA-BMP4能编码一个12.4kD的小肽,为了探究lncRNA-BMP4发挥功能的主体是RNA链还是其编码的小肽,分别构建了突变ORF起始密码子的RNA链过表达载体oelnc-ORFmut和小肽的过表达载体oeORF,以野生型lncRNA-BMP4过表达载体作阳性对照。体外形态学观察结果显示,空白对照组中第4d出现少量类胚体,第6d类胚体数量增多且体型变大;oelnc-ORFmut组和oeORF组第4 d就出现了大量的类胚体,第6 d数量更多;而阳性对照组生成类胚体数目最多。qRT-PCR检测第6 d时各组PGCs标记基因的表达,oelnc-ORFmut 组 Cvh上升至 29.759±2.827（P<0.05）;oeORF 组 Cvh上升至 30.294±3.735（P<0.01）,C-kit上升至 25.283±1.073（P<0.5）,阳性对照组 Cvh上升至 39.733±3.003（P<0.01）,C-kit上升至 29.687±2.107（P<0.01）;流式分析结果显示,与空白对照组相比,oelnc-ORFmut 组（16.747%±0.379）和 oeORF 组（17.739%±0.491）CVH阳性细胞率均极显著上升（P<0.01）,但均少于阳性对照组（29.298%±2.073）,间接免疫荧光结果与流式结果一致。以上结果均显示不仅lncRNA-BMP4的RNA链能促进PGCs形成,而且其编码的小肽也有相同功能。为了探究小肽行使功能的机制,构建带有His标签的小肽融合表达载体,ChIP检测结果显示编码的小肽作为转录因子结合在BMP4启动子区域。进一步构建野生型BMP4启动子载体和缺失小肽结合位点的BMP4启动子载体,分别与小肽过表达载体共转染DF-1。双荧光素酶报告系统检测结果显示,与对照组相比过表达小肽极显著提高BMP4启动子活性（329.938±28.938,P<0.01）,但突变了结合位点后,BMP4启动子活性极显著降低（119.398±12.874,P<0.01）,且在此基础上过表达小肽也不能影响BMP4启动子活性,结果说明小肽可结合在BMP4启动子区促进其转录。为了探究N6-甲基腺嘌呤是否影响lncRNA-BMP4编码小肽的能力,将小肽的His融合表达载体转染PGCs,在此基础上分别添加m6A激活剂MA和抑制剂NPC,Western Blot结果显示,当m6A水平升高,小肽的表达量减少,而m6A水平降低,小肽的表达量增加,说明低m6A水平可促进lncRNA-BMP4编码小肽,编码的小肽结合在BMP4启动子区激活BMP4表达。对体外诱导表达并纯化的小肽蛋白进行His pull-down联合质谱分析,得到了 236个互作蛋白;Co-IP结果显示小肽与DDX5结合,说明DDX5可能是小肽的互作靶蛋白,但其机制有待进一步研究验证。