唾液酸是在生物体内广泛存在的一类天然9碳糖酸类化合物,通常唾液酸以短链残基的形式链接在糖蛋白、糖脂等糖缀合物的末端。唾液酸最主要的两种结构是N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)和N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)。对人体而言,Neu5Ac是内源性唾液酸,促进神经系统、免疫系统与大脑的发育,属于对人体有益的唾液酸;而Neu5Gc是外源性唾液酸,Neu5Gc的摄入和累积使机体内产生Neu5Gc的抗体,引起抗原响应和炎症,促进慢性炎症发生,从而刺激肿瘤生长,进而引发癌症,属于对人体有害的唾液酸。结合态Neu5Gc主要存在于动物性食品并通过膳食途径进入人体,因此去除不同动物性食品中的唾液酸具有重要意义。而如今,水解唾液酸的方法大多是化学解离,例如,酸法水解等。而酸作用于食物中,会破坏食物中大部分营养物质的结构,并影响食用口感。本文探讨的是酶解释放法。该酶是以人体肠道共生菌Akkermansia muciniphila strain DSM22959基因组DNA为模板,克隆、表达,通过Nickel-NTA一步纯化得到单一条带的蛋白质。分别为Am0707、Am0705、Am1757、Am2085。通过目标酶酶解与商业酶、化学法酸解的比较,经以下实验证明可以将天然复杂糖链混合物肉样中的唾液酸Neu5Ac和Neu5Gc解离,并筛选出活性较好的Akkermansia源唾液酸糖苷酶。1.唾液酸糖苷酶对寡糖标准品中唾液酸的解离效果的比较对于寡糖标准品(N-糖连接及游离乳寡糖)上唾液酸的解离效果,通过对解离后的底物糖链进行2-AB标记,解离下的唾液酸用OPD标记,然后分别用高效液相进行检测。证明该四种酶均可解离唾液酸。通过对Am0707、Au及酸解法的内标法定量结果表明,Am0707的酶解效率为71%,优于商业酶Au的11%,接近于酸解。2.唾液酸糖苷酶对糖蛋白中唾液酸的解离效果的比较猪胃黏蛋白与胎球蛋白作为反应底物,样品前处理分为两组。第一组直接处理,将唾液酸糖苷酶分别直接加入糖蛋白样品中混匀、反应;第二组间接处理,先用β-消除法处理猪胃黏蛋白以及PNGaseF(N-糖酰外切糖苷酶F)处理胎球蛋白,以此将底物中的糖链与蛋白质分离,纯化并收集解离下的糖链,再分别用于唾液酸糖苷酶的解离。将这四种唾液酸糖苷酶和商业酶Au对两组糖蛋白(猪胃黏蛋白和胎球蛋白)上唾液酸进行解离,对解离下的游离唾液酸进行OPD标记,经高效液相检测发现,不论直接处理还是间接处理,Am0707的酶解效果优于另外三种目标酶。通过对Am0707、Au及酸解法的内标法定量,结果表明Am0707的酶解效率为51%,是酸解效率的一半,且优于商业酶Au的35%,验证了第二章的结果。3.唾液酸糖苷酶对天然复杂肉类样品中唾液酸的解离效果的比较天然复杂混合物肉样分为红肉(牛肉、羊肉、猪肉)、白肉(鸡肉)以及猪内脏(猪肝、猪肾、猪胃、猪肠)。经过简单的前处理搅碎、均质后,比较这四种唾液酸糖苷酶和商业酶Au对于肉样中唾液酸的解离情况,可以得出唾液酸在肉类当中的的分布情况和解离效果的差异。可知红肉中既含有Neu5Gc,也含有Neu5Ac;白肉中只含有Neu5Ac。对解离下的游离唾液酸进行OPD标记,通过对Am0707、Au及酸解法的内标法定量,结果表明Am0707的酶解效率为24%,约为酸解效率的四分之一,且优于商业酶Au的11%。验证了第二、三章唾液酸解离实验中,Am0707比商业酶Au酶解效果更好的结论。酶法水解红肉中的唾液酸,反应条件温和,可最大程度保证食物中营养物质的稳定。而如今大部分的唾液酸糖苷酶来源于病毒或细菌,解离食物中唾液酸的同时可能对身体健康带来不利,不允许用于食品唾液酸解离。本文的唾液酸糖苷酶来源于人体肠道共生茵Akkermansia mucinhila,将此应用于肉类加工中,不仅解离下有害唾液酸Neu5Gc,该种酶在实际使用的安全性也得到了保证,不会对机体产生不良作用,具有广泛的应用前景。