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长链非编码RNA（long non-coding RNA，LncRNAs）是一类长度一般超过200nt的RNA，其本身不参与或很少参与蛋白质的编码，以RNA的形式在多种层面上（表观遗传调控、转录调控及转录后调控等）调控基因的表达水平。本研究采用LncRNA芯片技术筛选可能参与食管癌发生发展的LncRNAs，通过实时荧光定量PCR(Real-time PCR)验证食管癌细胞及组织中筛选出来的LncRNA-UCA1，识别其与食管癌发病风险之间的关系，进一步检测细胞凋亡、增殖、周期、迁移及侵袭5个指标，评价LncRNA-UCA1对食管癌细胞生物学行为影响及可能的调控机制，以期达到发现诊断早期食管癌病人肿瘤标志物的目的。 一、LncRNA-UCA1与食管癌发病风险的流行病学研究 本研究募集70例原发食管癌患者的癌组织及配对癌旁组织。选取其中3例食管癌组织及其配对癌旁组织应用LncRNA表达谱芯片分析，筛选出上调LncRNAs基因399个，下调LncRNAs基因620个。与现有食管癌相关LncRNAs数据库的比对分析，在本次研究中3对组织样品筛选出的表达差异有统计学意义的所有LncRNAs中有13个与之相同，表达上调的有3个(AJ006998.2，AC034220.3，AL035610.2)，表达下调的有3个（RP11-38M15.6，NCRNA00092，UCA1），选择差异显著的LncRNA-UCA1在70对食管癌与癌旁组织，构建stem-loop real time RT-PCR技术，探讨LncRNA-UCA1与食管癌发病风险之间的关系。结果显示，LncRNA-UCA1在食管癌组织的表达水平平均为配对癌旁组织表达水平的0.221倍(P＜0.05)，LncRNA-UCA1的下调与食管癌发病风险的增加有显著关联。提示LncRNA-UCA1可作为食管癌高危人群筛检和早期诊断的候选生物标志。 二、LncRNA-UCA1在食管癌细胞中表达情况及其对细胞生物学行为的影响 应用qRT-PCR技术，以18S为内参，对LncRNA-UCA1在食管细胞中的表达情况进行检测，4株食管癌细胞株(EC109、EC9706、TE1、C17)与1株永生化食管上皮细胞株(Het-1A)相比，LncRNA-UCA1在EC109、EC9706、TE1、C17中均表达下调，表达水平分别为Het-1A的0.00033、0.0048、0.62、0.88倍(P＜0.05)。 高表达LncRNA-UCA1慢病毒成功转染食管癌细胞株EC10996h后，qRT-PCR检测LncRNA-UCA1转染组表达水平为阴性对照组的366.33倍(P＜0.05)。转染成功进行后续细胞生物学功能实验: 1.EdU细胞增殖结果显示，LncRNA-UCA1高表达组细胞增殖率为（33.46±4.58）％，阴性对照组增殖率为（76.66±10.11）％，实验组与阴性对照组差异存在统计学意义(P＜0.05)，高表达1ncRNA-UCA1可明显抑制细胞增殖能力。 2.流式细胞技术检测细胞凋亡(Annexin-Ⅴ标记法)表明，转染96h后的实验组、阴性对照组、空白对照组早期凋亡率分别为(2.44±0.39)％、（2.34±0.37）％、（1.61±0.32）％，统计分析发现实验组与阴性对照、阴性对照与空白对照的差异均不存在统计学意义，高表达LncRNA-UCA1对细胞凋亡能力无影响。 3.流式细胞技术检测细胞周期（PI染色法），转染96h后的实验组及阴性对照组G1期分别为（36.10±0.38）％、(35.63±0.71)％，G2期分别为(36.10±2.52)％、(40.96±0.44)％，S期分别为(27.80±2.41)％、（23.41±1.02）％，统计分析发现，实验组与阴性对照组G1期差异不存在统计学意义，G2期及S期差异存在统计学意义(P＜0.05)。LncRNA-UCA1高表达诱导食管癌细胞周期阻滞在S期，正常分裂活动受阻，抑制肿瘤细胞增殖。 4.Transwell迁移实验表明，LncRNA-UCA1高表达组（实验组）穿膜细胞数为21.80±4.64，而阴性对照组是59.27±1.96，MTT测得穿膜细胞OD值在实验组和阴性对照组中分别为0.13±0.02、0.28±0.01，实验组与阴性对照组差异存在统计学意义(P＜0.05)，高表达LncRNA-UCA1后，穿过基底膜细胞数减少，食管癌细胞EC109的迁移能力减弱 5.Transwell侵袭实验表明，LncRNA-UCA1高表达组穿Matrigel基质胶细胞数为5.25±0.66，而阴性对照组是14.8±3.37，MTT测得穿过Matrigel基质胶的细胞OD值在实验组和阴性对照组中分别为0.09±0.03、0.20±0.02，实验组与阴性对照组差异存在统计学意义(P＜0.05)。高表达LncRNA-UCA1后，穿Matrigel基质胶细胞数减少，细胞体外侵袭能力减弱。 三、LncRNA-UCA1在食管癌细胞中靶基因识别与验证 慢病毒转染食管癌细胞株EC109使其高表达LncRNA-UCA1，应用全基因组芯片对3组LncRNA-UCA1高表达食管癌细胞和阴性对照食管癌细胞mRNA基因差异表达谱进行研究。对差异表达mRNA做KEGG pathway分析后发现与食管癌细胞密切相关的通路有Wnt信号通路。涉及相关基因9个（ctnnb1，daam2，dkk1，frat1，nfatc3，tcf7，vangl1，vangl2，wnt2b），将其中经典Wnt/β-Catenin通路关键基因（wnt2b，dkk1，frat1，ctnnb1，tcf7，c-myc）作为候选靶基因。对其中涉及基因进行qRT-PCR验证发现，细胞周期相关基因wnt2b、dkk1上调，frat1、ctnnb1、tcf7、c-myc下调，dkk1及c-myc差异具有统计学意义(P＜0.05)。而Western Blot结果提示，高表达LncRNA-UCA1后，EC109细胞中DKK1蛋白表达较对照组未见明显差异，提示LncRNA-UCA1可能间接调控dkk1，c-myc从而通过WNT经典通路影响食管癌细胞增殖、周期等生物学行为。