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杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida,E.piscicida)是一种革兰氏阴性杆菌,主要通过肠道感染各种养殖鱼类,对水产养殖业造成了巨大的经济损失。双组分系统(Two-Component System,TCS)是细菌广泛使用的信号转导系统,它可以响应环境信号参与基因调控网络,在病原菌感染过程中发挥重要作用,具有作为药物作用靶点的潜力。FusKR是一种重要的TCS,研究表明,肠出血性大肠杆菌(EHEC)中的FusKR可以通过感应宿主肠道内的岩藻糖来调节其代谢和致病性,然而E.piscicida的FusKR主要功能尚不明确。本研究在前期研究的基础上,进一步探索FusKR在E.piscicida中的调控作用,以期阐明FusKR的关键蛋白和作用路径,为爱德华菌病的防控提供理论支撑。我们首先分析了岩藻糖对E.piscicida的FusKR关键基因fusK(编码激酶FusK)、fus R(编码调节蛋白Fus R)及其调控的下游基因ETAE_1977(编码岩藻糖转运蛋白Fuc P)的影响。在含有和不含30 m M L-岩藻糖(L-fucose)的LB培养基中分别培养E.piscicida野毒株EIB202,RT-q PCR结果显示,与在普通LB培养基中相比,EIB202在含有岩藻糖的培养基中其fusK基因(P<0.05)、fus R基因(P<0.05)以及ETAE_1977基因(P<0.01)的转录水平显著性升高,L-fucose促进它们的转录表达。我们接下来对fusK基因和fus R基因的功能做了进一步的研究。首先构建了EIB202的fusK基因缺失菌株?fusK和fus R基因缺失菌株?fus R,经过50代传代培养后,缺失掉的基因并没有回复突变,?fusK和?fus R具有遗传稳定性;ΔfusK和Δfus R在SS琼脂培养基上依然呈中央黑色、边缘半透明的菌落;EIB202、ΔfusK和Δfus R在LB培养基中的生长性能差异不显著(P>0.05),表明fusK和fus R基因不是E.piscicida的生长必需基因,而在DMEM培养基(无糖)中加入30 m M L-fucose后,Δfus R更快进入生长稳定期(P<0.05);EIB202、ΔfusK和Δfus R的运动性检测结果显示,ΔfusK和Δfus R比EIB202的运动环直径小(P<0.01),fusK基因和fus R基因的缺失均减弱E.piscicida的运动能力。我们分析了fusK基因和fus R基因分别对FusKR的影响。在含有和不含30 m M L-fucose的LB培养基中分别培养EIB202、ΔfusK和Δfus R,通过RT-q PCR分析发现,与EIB202相比,无论是在普通LB培养基还是加入岩藻糖的LB培养基中,ΔfusK的ETAE_1977基因和fus R基因的转录水平均显著性降低(P<0.05),无岩藻糖的情况下,fusK基因促进它们的转录,fusK基因也可以通过感应岩藻糖促进它们的转录;与EIB202相比,无论是在普通LB培养基还是加入岩藻糖的LB培养基中,Δfus R的ETAE_1977基因和fus R基因的转录水平均显著性升高(P<0.01),在无岩藻糖的情况下,fus R基因抑制它们的转录,fus R基因也可以通过感应岩藻糖抑制它们的转录。激酶FusK在EHEC中发挥主要的信号感应和调节作用,我们筛选了E.piscicida的FusK的互作蛋白。我们构建了带有His标签的p ET28a-FusK融合蛋白表达载体,将其诱导表达纯化并验证后作为诱饵蛋白,与EIB202菌株总蛋白共同孵育,通过His pull-down试验“垂钓”EIB202总蛋白中直接或间接与FusK结合的靶蛋白。经由LC-MS/MS质谱分析,共鉴定到1285个潜在的与FusK相互作用靶蛋白。进而对这些蛋白质进行GO(Gene Ontology)功能分析、COG(Cluster of Orthologous Groups)注释和Pathway注释,结果显示,筛选到的互作蛋白中有与E.piscicida毒力相关的蛋白,如Ⅲ型分泌系统(T3SS)和VI型分泌系统(T6SS)相关蛋白,还有多数代谢相关蛋白,如甘油-3-磷酸1-O-酰基转移酶Pls B(参与耐氧化应激),FusKR系统调节E.piscicida的毒力和代谢。针对互作蛋白的分析结果,我们检测了EIB202、ΔfusK和Δfus R的生物被膜形成能力、耐氧化应激能力、T3SS效应基因(ese E)和T6SS效应基因(evp J)转录水平差异。通过定量(结晶紫染色法)和定性(DAPI染液染色法)检测EIB202、ΔfusK和Δfus R的生物被膜形成能力,结果显示在6(P<0.05)、12(P<0.01)和24 h(P<0.05)时,ΔfusK和Δfus R的生物被膜形成能力均弱于EIB202,并且在12 h时差异最显著,FusKR系统增强E.piscicida的生物被膜形成能力;耐氧化应激试验结果显示,EIB202、ΔfusK和Δfus R经过10 mmol/L H2O2处理15 min后,ΔfusK的存活率低于EIB202(P<0.01),fusK基因的缺失减弱了E.piscicida的耐氧化应激能力,Δfus R的存活率高于EIB202(P<0.01),fus R基因的缺失增强了E.piscicida的耐氧化应激能力。分别在含有和不含30 m M L-fucose的LB培养基中培养EIB202、ΔfusK和Δfus R,通过q PCR分别检测ese E基因和evp J基因的转录差异。结果显示,与无岩藻糖LB培养基培养的EIB202相比,在含有岩藻糖时,EIB202中ese E基因(P<0.01)和evp J基因(P<0.01)的转录水平显著上升,L-fucose促进它们的转录。在无岩藻糖的条件下,fusK基因的缺失抑制ese E基因(P<0.01)和evp J基因的转录(P<0.05);在含有游离岩藻糖的条件下,fusK基因可以抑制ese E基因(P<0.05)和evp J基因的转录(P<0.05),L-fucose对ese E基因和evp J基因转录的促进作用强于fusK基因通过感应岩藻糖信号产生的抑制作用。在无岩藻糖时,fus R基因的缺失抑制ese E基因(P<0.01)的转录,在含有游离岩藻糖时,与EIB202相比,Δfus R中ese E基因的转录水平无显著性差异(P>0.05);fus R基因对evp J基因转录水平的影响与fusK基因对其影响相似。综上所述,我们初步研究了E.piscicida新型双组分系统FusKR关键基因fusK和fus R的功能,发现FusKR对其生物被膜形成、耐氧化应激和重要毒力因子(T3SS和T6SS)都有显著的调节作用,在多种病原菌中这些性状参与耐药、抵抗宿主免疫系统并对宿主产生极大伤害,我们认为FusKR双组分系统具有作为靶点来研发新型药物的潜力,本研究为E.piscicida致病机理的研究和防控技术的研发提供了新的思路和理论。