分裂是细菌生长、繁殖的基础。菌体的分裂过程需要精准的调控机制来确保其准确性，从而维持正常的生命活动。对分裂过程的任何干扰，都会对细菌生命活动产生重要影响，甚至导致死亡。目前的研究表明，细菌的分裂是一个非常复杂，需要进行严格精确的时空调控的行为，但仍然有许多未知的机制有待进一步的阐释。本实验室在前期对细菌群集运动的研究中，用自杀性质粒对弗氏枸橼酸杆菌ATCC8090菌株进行广泛转座诱变，在众多的突变株中分离出编号为204的转座突变株。该突变株生物学性状发生明显变化，相对野生株其形态显著变长，表现为长丝体。经过反向 PCR 方法确定发生突变基因为yeeZ基因。为进一步确认此现象，我们利用自杀性载体EK-Ⅱ对弗氏枸橼酸杆菌野生株的yeeZ基因进行单交叉突变，获得的突变株形态同样出现明显的变长。　　 迄今为止，尚无关于yeeZ基因功能的研究报道，通过NCBI 网站检索分析得知，大肠杆菌的yeeZ基因编码产物被预测为与糖代谢有关的差向异构酶，可能参与了多糖链的合成。有文献报道，在大肠杆菌中，yeeZ、yeeN两个基因的产物是以蛋白复合物的形式存在，提示YeeZ是通过与YeeN 相互作用来发挥功能的，虽然YeeN的确切功能未知，但有研究显示，其突变会导致细菌生长异常。在弗氏枸橼酸杆菌的基因组上，yeeZ基因与其下游的yeeY基因在一个操纵子中。yeeY基因功能同样没有研究报道，根据序列相似性被推测为LysR家族转录调控因子。LysR家族的转录调控因子是原核生物中最主要的转录调控因子，其所调控的基因功能繁多，涉及氨基酸、酶的合成代谢、毒力因子合成、群体感应系统以及运动等，因此理论上也存在调控分裂的可能性。　　 据此，我们针对204株丝状体形成原因提出三种推测：（1）yeeZ基因功能直接涉及分裂，因此其突变后，导致菌体变长；（2）转座子对yeeZ基因的插入突变，并非是表型形成的原因，而是由于极效应导致其下游基因yeeY的失活，而形成丝状体；（3）YeeZ是通过与其它蛋白形成复合体发挥功能，yeeZ基因插入突变后，导致原基因部分片段的表达，干扰了正常功能的发挥，进而导致表型形成。　　 对204株丝状体形成原因的确定，将有助于认识yeeZ基因的功能，并可能发现新的影响细菌分裂的机制。有鉴于yeeZ基因的插入突变导致细菌生长显著缓慢，类似机制有可能应用于减毒疫苗的构建，而对其机制的阐明，将有助于应用研究的开展。　　 据此，我们针对三种推测进行了以下的实验研究：　　 1．革兰阴性菌基因敲除载体pYG4的构建。　　 为方便进行目的基因的功能分析，我们构建了适用于革兰阴性菌基因敲除的载体pYG4。该载体主要包含以下成分：π蛋白依赖性复制起点ori R6K，使构建的质粒只能在表达π蛋白的菌株中复制，对于其它细菌表现自杀性；接合转移基因mob，使载体可以通过简单的接合方式实现转移；多克隆位点序列：EcoRⅠ-XbaⅠ-ApaⅠ-SfiⅠ-SacⅠ　　 -NotⅠ-SpeⅠ-NdeⅠ-SacⅡ-BglⅡ，可以满足克隆需要；反向选择标志sacB 该基因编码的酶可将蔗糖分解为对细菌有毒的产物, 从而杀死表达它的细菌；正向选择标志卡那霉素抗性片段。该载体适用于对革兰阴性菌进行目的基因的各种突变操作，在使用上比较方便，也具有较广泛的“失活谱”，目前已经得到很好的应用。　　 2．弗氏枸橼酸杆菌yeeZ基因的敲除及形态观察。　　 利用自杀载体pYG4对yeeZ基因进行框架内敲除，敲除是从转录起始位点下游18bp处开始，到终止子上游36bp 处终止，有效避免因为极效应而干扰下游基因的表达，且有效的去除了yeeZ基因功能。观察发现敲除株菌体形态没有明显变化，说明yeeZ基因功能的缺失不是导致204 突变株形态变长的原因。由此否定上述第一个推测：即yeeZ基因功能直接涉及细胞分裂，突变后会导致菌体变长。　　 3．弗氏枸橼酸杆菌yeeZ、yeeY 双基因的敲除及双基因互补株的构建采用同样方法对yeeZ、yeeY 双基因进行敲除，但敲除株形态同样没有出现明显的变化。通过PCR 扩增yeeZ+yeeY 完整基因片段及其调控区域，并将其连接至载体pBR322，将重组质粒导入204 突变株，发现菌体形态没有恢复正常。由此否定了第二个推测，说明yeeY基因功能的缺失不是造成204 突变株菌体变长的原因。　　 4．204 突变株yeeZ基因突变区域分析及表达4.1首先对204株yeeZ基因突变区域序列进行完整克隆，将其克隆到T 载体上，目的是观察该突变体对细菌的影响，在实验中我们没有获得带有目的片段载体的大肠杆菌DH5α菌株，但获得了目的片段整合到基因组的同源位置上的大肠杆菌DH5α菌株，该菌株实际上发生了与弗氏枸橼酸杆菌204株类似的插入突变。对其性状观察发现，其在平板上只能有限生长，形成很小的菌落，涂片显示其形成显著的长丝体。这说明yeeZ基因的插入突变也会对大肠杆菌的分裂产生显著的影响。4.2 我们采用RT-PCR对204株基因组上转座片段的前后区域的转录情况进行了分析，发现在转座子插入yeeZ基因后，其插入位点的前半部分和后半部分均能转录。　　 4.3 采用PCR 扩增方式对204 突变株yeeZ基因后半部分突变区域进行克隆并测序验证，将该片段连接至载体pBR322，将重组质粒电转入弗氏枸橼酸杆菌野生株，发现该部分片段对菌体形态没有产生明显影响。　　 4.4 采用PCR 扩增方式对204 突变株yeeZ基因前半部分突变区域进行克隆。首先将该片段连接至T 载体，将重组质粒电转入大肠杆菌DH5α发现部分克隆生长异常，表现为迟缓生长或者不生长，对能够正常生长的克隆进行测序发现均有不同的突变。于是我们重新扩增yeeZ基因前部分片段（从yeeZ基因起始密码子后开始扩增），将其连接至载体pBAD24，进行阿拉伯糖诱导表达，结果显示在0.2％ ara+LB平板明显的生长抑制。　　 通过以上实验，我们确定204 突变株分裂抑制形成丝状体的原因是由于yeeZ基因前210bp 片段的表达所导致，根据文献分析，其机制可能是干扰了与YeeN 相互作用关系，确切机制尚有待深入研究。　　 通过本研究，我们确定了204 突变株形成丝状体的原因，明确了yeeZ基因功能的重要性，其与分裂过程并非直接的作用关系，而是一个间接的作用。我们同时发现，突变的yeeZ基因对分裂的抑制，不仅仅表现在弗氏枸橼酸杆菌中，在大肠杆菌中也有存在。有鉴于yeeZ基因的插入突变导致细菌生长显著缓慢，大肠杆菌突变株甚至只能有限生长，类似机制可应用于相关细菌减毒疫苗的构建。