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目的:通过观察脾气虚证大鼠海马神经元线粒体动力学和线粒体自噬机制的变化,从线粒体方面研究脾气虚的发生机制。材料与方法:1动物分组雄性SPF级SD大鼠16只,随机分为对照组(8只)、模型组(8只),适应性饲养一周后开始实验。光照:12h:12h,室温18℃~23℃,相对湿度45%~55%,自由饮水进食。2脾气虚证模型的建立及评价2.1模型建立模型组在15日内a.先饱食1日,再禁食2日,不禁水,共5个循环;b.每日水温28~30℃游泳至力竭。2.2模型评价a.消瘦:体质量明显下降为达标;b.食少:代谢笼计量24h单只进食量和饮水量,均明显减少为达标;c.神疲:检测大鼠5min内在旷场实验中的运动距离和站立次数,显著下降为达标;d.乏力:抓力明显变小为达标。e.毛发枯槁:三人分别判断,结论一致为达标。3取材各组大鼠空腹12h后,腹腔注射10%水合氯醛(0.35ml/100g体重)麻醉,4℃冰上取海马组织,切取1mm×1mm×1mm小块置于2.5%戊二醛固定,其余-80℃冻存备用。4海马神经元线粒体形态观察取2.5%戊二醛,固定组织,PBS漂洗,1%锇酸固定,乙醇、丙酮梯度脱水,环氧树脂包埋切片后,3%醋酸铀-枸橼酸铅双染,透射电镜下观察海马神经元细胞核、粗面内质网、核糖体及线粒体膜完整性、线粒体分裂融合情况和嵴的形态;重点观察吞噬泡和自噬体情况等。5海马神经元线粒体功能评价取冻存组织,采用比色法/JC-1法,提取总蛋白或线粒体,检测ATP水平、线粒体膜电位、过氧化氢水平。6海马神经元线粒体相关蛋白表达取冻存组织,采用Western blot法,提取总蛋白/线粒体蛋白,检测Drp1、Mff、Fis1、Mfn1、Mfn2、Opa1、PINK1、Parkin、LC3B和p62蛋白表达。7数据处理采用SPSS17.0统计软件,数据以均数±标准差(~_X±S)表示,P<0.05为有统计学意义。结果1模型评价对照组大鼠体格健壮,反应迅速,被毛紧密有光泽;模型组大鼠消瘦,反应迟钝,被毛蓬起枯槁无光泽。与对照组比较,模型组体重、进食量、饮水量、运动距离、站立次数以及前肢抓力均下降,模型复制成功。2海马神经元线粒体形态对照组线粒体嵴丰富且存在较多自噬体,而模型组线粒体嵴有减少现象,且自噬体较少。3线粒体功能对照组与模型组海马神经元ATP含量分别为0.014±0.003和0.011±0.002mmol/g(n=8,P<0.01);线粒体膜电位分别为0.698±0.042和0.580±0.007(n=8,P<0.01);过氧化氢含量分别为0.774±0.119和1.589±0.193 mM(n=8,P<0.01)。4促分裂蛋白Drp1、Mff及Fis1表达对照组与模型组海马神经元Drp1相对表达量分别为1.060±0.060和1.450±0.090(n=4,P<0.01);Mff相对表达量分别为0.842±0.0945和1.151±0.023(n=4,P<0.01);Fis1相对表达量分别为0.740±0.037和0.859±0.054(n=4,P>0.05)。5促融合相关蛋白Mfn1、Mfn2及Opa1表达对照组与模型组海马神经元Mfn1相对表达量分别为0.618±0.035和0.667±0.013(n=4,P>0.05);Mfn2相对表达量分别为0.691±0.023和0.924±0.046(n=4,P<0.01);Opa1相对表达量分别为0.804±0.049和0.562±0.068(n=4,P<0.05)。6线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin、LC3B-II和p62表达对照组与模型组海马神经元PINK1相对表达量分别为1.193±0.145和0.663±0.115(n=4,P<0.05);Parkin相对表达量分别为1.257±0.152和1.031±0.180(n=4,P<0.05);LC3B-II相对表达量分别为0.616±0.072和0.450±0.073(n=4,P<0.05);p62相对表达量分别为0.693±0.288和1.195±0.111(n=4,P<0.05)。结论1.脾气虚的发生与海马神经元线粒体分裂增强和内膜融合停滞有关;2.脾气虚的发生与海马神经元线粒体自噬水平下降有关。