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目的:构建体外百草枯(paraquat,PQ)细胞纤维化模型,观察PQ对II型肺泡上皮细胞(A549细胞)中解整合素-金属蛋白酶17(a disintegrin and metalloproteinase-17,ADAM17)表达的影响和探讨ADAM17在PQ中毒致肺纤维化中的作用。方法:1.建立细胞纤维化模型:1)体外培养A549细胞,将对数生长期的A549细胞分为正常组、PQ组(50、100、200、400、600、800、1000umol/L),分别作用12h、24h、36h、48h,应用CCK-8法检测细胞存活率,筛选出理想的PQ浓度(50、100、200umol/L)和作用时间(12h、24h、48h)。2)将对数生长期的A549细胞分为正常组、PQ组(50、100、200umol/L),作用24h,应用倒置相差显微镜观察细胞形态,采用酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定各组纤维化标志物I型胶原(type I collagen,Col I)和纤连蛋白(fibronectin,FN)的表达,以确认纤维化模型的成功。2.观察ADAM17在本细胞模型中的表达:将A549细胞分为正常组、PQ组(PQ浓度50、100、200umol/L),作用12h、24h、48h,采用(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)、免疫细胞化学(immunocytochemistry,ICC)及蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)分别检测ADAM17 m RNA和蛋白的表达。3.ADAM17在PQ中毒致肺纤维化中的作用探讨:使用ADAM17抑制剂(tumor necrosis factor-αprocessing inhibitor-1,TAPI-1),初步探讨ADAM17在PQ中毒细胞模型中的作用;以TAPI-1进行干预,将对数生长期的A549细胞分为正常组、PQ组(200umol/L)、PQ+TAPI-1组(PQ 200umol/L+TAPI-1 20umol/L),作用时间24h,RT-PCR、ICC及Western blot分别检测ADAM17 m RNA及蛋白的表达情况,以CCK-8法检测各组细胞活力,倒置相差显微镜观察细胞形态,ELISA测定各组Col I、FN的表达量。结果:1.随着PQ浓度增加及作用时间延长,A549细胞活性呈下降趋势(P<0.05),呈浓度和时间依赖性。2.倒置显微镜下正常的A549细胞融合呈铺路石样生长,排列比较紧密,经PQ诱导后细胞排列较松散,细胞间连接变疏松,部分细胞溶解、死亡。3.ELISA结果显示,随PQ浓度增加,Col I和FN表达增强(P<0.05),成功建立PQ诱导的细胞纤维化模型。4.百草枯细胞纤维化模型中有ADAM17的表达:1)ICC显示,ADAM17在A549细胞胞浆表达,随PQ浓度增加,黄色阳性颗粒沉积越多。2)RT-PCR和Western blot表明,随着PQ浓度增加,ADAM17 m RNA及蛋白水平表达明显增加(P<0.05);随着PQ作用时间延长,ADAM17 m RNA及蛋白水平表达增加(P<0.05),在24h达到高峰,呈一定时间依赖性。5.TAPI-1抑制ADAM17的表达和纤维化:1)ICC显示,PQ+TAPI-1组细胞质中黄色阳性颗粒的沉积较PQ组减少。2)RT-PCR及Western blot表明,PQ+TAPI-1组较PQ组相比,ADAM17 m RNA及蛋白表达水平均下调(P<0.05)。3)CCK-8结果提示PQ+TAPI-1组细胞活力较PQ组有所改善(P<0.05)。4)显微镜下观察PQ+TAPI-1组细胞形态及细胞间隙介于正常组和PQ组之间,细胞溶解较PQ组减少。5)ELISA结果显示,PQ+TAPI-1组较PQ组Col I和FN的表达下降(P<0.05)。结论:1.百草枯构建体外A549细胞纤维化模型。2.百草枯对A549细胞的毒性作用具有浓度和时间依赖性。3.ADAM17在百草枯诱导的A549细胞中过表达,可能参与了百草枯诱导的肺纤维化过程。4.TAPI-1通过抑制ADAM17的表达,从而达到抑制百草枯肺纤维化的作用。