论文部分内容阅读
小麦是世界上种植面积最广的粮食作物,其重要性不言而喻,干旱严重制约小麦生产。小麦拔节期对干旱胁迫异常敏感,干旱导致植物激素脱落酸（ABA）在体内积累,进而使植物对干旱胁迫产生应答反应,ABA信号通路在逆境响应中起关键作用。蔗糖非发酵相关蛋白激酶2（Sucrose Non-fermenting 1-Related protein Kinase 2,Sn RK2）是ABA信号通路中的重要调控因子,是多种生物过程和逆境应答反应的信号传导枢纽。但是小麦TaSnRK2.10在干旱逆境响应中的作用机制尚未完全阐明。本研究克隆了小麦TaSnRK2.10基因,通过转基因水稻研究了TaSnRK2.10在生长发育和抗旱中的功能,通过筛选酵母文库发现候选互作蛋白Ta ERD15（Early Responsive to Dehydration 15）和Ta ENO1（Enolase 1）,并通过酵母双杂交、萤火虫荧光素酶报告试验、双荧光素酶试验、免疫共沉淀、蛋白下拉试验等方法进行验证,并通过转基因水稻对互作蛋白Ta ERD15在干旱下的抗旱机理进行了初步研究,探索其响应干旱胁迫的分子和生理机制,取得以下主要结果。首先,通过对小麦抗旱品种晋麦47在干旱胁迫条件下拔节期幼穗的转录组数据分析,发现ABA信号通路关键调节基因TaSnRK2.10显著上调表达。聚乙二醇处理后,TaSnRK2.10在不同旱敏感型小麦中的表达模式也证明了TaSnRK2.10应答干旱胁迫。其次,氨基酸序列相似性比较发现TaSnRK2.10与Sn RK2家族相应成员间具有高度相似性（相似性范围为94.5%～100%）,尤其是与禾本科植物Sn RK2s的相似性较高,而与双子叶植物Sn RK2s的相似性较低（79.2%～85.6%）。氨基酸多序列比对发现TaSnRK2.10蛋白高度保守,包括N端的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域和C端的结构域Domain I（响应渗透胁迫）和Domain II（响应ABA）,小麦A、B、D三个基因组的TaSnRK2.10之间仅有1个氨基酸的差异（S250A）,其位于保守结构域之外,且不引起蛋白质二级结构的改变。系统进化树分析可知,小麦三个基因组的TaSnRK2.10与其祖先种关系最近,且与其他单子叶植物（尤其是禾本科植物）的Sn RK2s聚为一类,如水稻、玉米、大麦、高粱等。对基因的表达分析显示,TaSnRK2.10在小麦拔节期的各个组织中均有表达,在地上部组织中的表达量高于根中的表达量;对TaSnRK2.10在多种非生物胁迫和外源激素处理下的表达模式分析可知,TaSnRK2.10受ABA诱导快速表达,同时也受聚乙二醇、高盐、低温、高温以及茉莉酸甲酯的诱导表达。第三,为进一步研究TaSnRK2.10的生物学功能,创制了TaSnRK2.10过表达的转基因水稻株系。种子萌发试验表明,高水平过表达TaSnRK2.10使水稻种子萌发对ABA高度敏感,而较低水平过表达TaSnRK2.10株系的萌发率与WT（Wild Type）无显著差异;通过对TaSnRK2.10转基因水稻和WT苗期、孕穗期和成熟期的生长发育指标和产量性状的统计分析发现,TaSnRK2.10高表达使转基因水稻的株高、分蘖数、最大根长和根干重显著降低、产量显著下降,而表达水平相对较低的株系OE-144其生长指标与WT无显著差异。第四,TaSnRK2.10通过多水平、多层次的调控提高转基因水稻的抗旱性。在生理层面,TaSnRK2.10通过调节气孔开闭、降低叶片失水率,提高叶片含水量,同时提高细胞膜稳定性、降低丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量、提高干旱存活率,增强抗旱性。转录组分析可知,TaSnRK2.10通过调控ABA信号通路（PP2C家族成员和ABI5家族成员）和JA信号通路（TIFY11b）等相关基因的表达来增强抗旱性。代谢组学分析显示,干旱胁迫条件下,TaSnRK2.10通过降低多种基础代谢,显著提高非酶类抗氧化物水平,如抗坏血酸、6-O漠食子酰葡萄糖（单宁）和类黄酮类物质,进而协调植物代谢平衡,提高抗旱性。第五,为了进一步研究TaSnRK2.10参与抗旱反应的信号通路,通过筛选酵母文库得到两个新的互作蛋白Ta ERD15和Ta ENO1,并通过酵母双杂交试验、萤火虫荧光素酶报告试验、双分子荧光互补试验、免疫共沉淀试验和pull-down试验做了进一步验证。Phos-tag试验证明Ta ERD15和Ta ENO1是TaSnRK2.10的磷酸化底物。与野生型水稻相比,Ta ERD15过表达转基因水稻株系在干旱胁迫下的MDA含量显著增加,存活率显著降低,表现为对干旱敏感的表型。TaSnRK2.10能够磷酸化Ta ERD15的第91位丝氨酸,磷酸化的Ta ERD15通过26S蛋白酶体途径被降解,进而消除其对抗旱性的不利影响。Ta ENO1受ABA和PEG诱导表达,主要通过调节代谢物磷酸烯醇式丙酮酸的代谢水平参与植物的抗旱过程。综上所述,本研究基于小麦拔节期干旱胁迫的穗部转录组数据鉴定到一个响应干旱的TaSnRK2.10蛋白激酶,通过转基因水稻发现TaSnRK2.10在生理生化水平、转录水平和代谢水平多层次响应干旱胁迫。同时,发现了两个新的TaSnRK2.10互作蛋白Ta ERD15和Ta ENO1,Ta ERD15过表达水稻株系表现为干旱敏感,TaSnRK2.10通过磷酸化Ta ERD15消除其对抗旱性的不利影响。TaSnRK2.10高水平过表达提高了转基因水稻的抗旱性,TaSnRK2.10较低水平过表达的转基因水稻生长指标和抗旱性与野生型无显著差异。因此精确调节TaSnRK2.10的表达水平在作物育种中具有重要意义,干旱诱导型启动子可能是一个较好的选择。