蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)是一种依赖磷脂和钙的蛋白激酶,是Ca2+信号途径中的成员。为了明确蛋白激酶C与分生孢子萌发、附着胞形成及致病性之间的关系,本文利用PKC特异性抑制剂—白屈菜赤碱(chelerythrine)研究了玉米大斑病菌分生孢子萌发、附着胞形成以及对玉米叶片表皮细胞的侵入等主要致病过程;利用Genome Walking技术克隆了PKC基因5’端上游约1.5 kb的DNA序列,采用生物信息学技术分析了该区域含有的主要元件,预测了该基因的功能;进一步优化了玉米大斑病菌原生质体的制备条件,构建了PKC基因同源重组载体和反义诱导表达载体,利用PEG介导系统转化玉米大斑病菌原生质体,获得转化菌株。利用PKC特异性抑制剂—白屈菜赤碱(chelerythrine)的研究发现,在含有10μmol/L抑制剂的PDA培养基上,玉米大斑病菌菌丝的生长受到了明显抑制,菌落的颜色没有变化,仍为灰黑色;抑制剂处理的分生孢子能正常萌发,形成的附着胞颜色与形状都没有变化,但是附着胞不能直接穿透玉米叶片的表皮细胞,而是趋向于从气孔侵入叶片内部;抑制剂处理后的孢悬液接种玉米叶片3周后没有呈现出病害症状。从含有10μmol/L抑制剂的PDA培养基上培养的玉米大斑病菌菌丝中提取的HT-毒素在玉米叶片上仍显示出较强的致病活性,表明白屈菜赤碱对玉米大斑病菌产生HT-毒素没有明显影响。基于pBS和pSO1质粒分别构建了玉米大斑病菌PKC基因敲除载体和反义表达载体。利用PEG介导的转化系统,转化玉米大斑病菌原生质体获得27个基因敲除阳性转化子。对继代培养后的阳性转化子进行PCR验证,获得12个潮酶素磷酸转移酶基因插入的转化菌株。转化菌株的菌落平坦、菌丝纤细,产孢能力降低。获得质量高、数量多的原生质体是遗传转化的关键技术之一。在稳渗剂较适宜的条件下,菌龄、酶种类与浓度配比、酶解温度及酶解时间是影响原生质体形成的最重要的5个因素,所以本文研究了这5个因素对玉米大斑病菌原生质体制备的影响。结果表明,制备玉米大斑病菌原生质体最佳条件为菌龄24 h,酶组合与酶浓度为1%溶壁酶+1%蜗牛酶+1%崩溃酶,酶解温度30℃,酶解时间4 h。在此条件下,可以产生10个左右原生质体(显微镜×400),约6×105个/mL。利用Genome Walking技术获得PKC基因5’端上游约1.5 kb的DNA序列。生物信息学分析没有发现类似TATA盒的元件,存在热激转录因子(HSF)结合元件和SP1、AP1等结合元件,推测PKC基因在该菌耐热性、交配型基因表达和寄主信号识别等方面发挥作用。以上结果初步明确了玉米大斑病菌PKC基因与病菌分生孢子萌发、附着胞形成、侵入及菌丝生长之间的关系。为进一步研究玉米大斑病菌的致病机理以及植物与病原物分子互作和开发新的植物病害防治方法奠定了基础。