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背景与目的:黑色素瘤是转移率和死亡率最高的皮肤恶性肿瘤。手术切除是早期黑色素瘤治疗的有效方式,但由于黑色素瘤细胞增殖速度较快,侵袭转移能力极强,使目前包括化疗、放疗、分子靶向治疗和免疫治疗等在内的治疗手段在治疗晚期黑色素瘤上显得捉襟见肘。因此,探明黑色素瘤发病机理和识别特异性的靶点对于恶性黑色素瘤精准治疗具有重要意义。近期研究发现,三磷酸腺苷酶家族蛋白3A(ATPase family AAA-domain containing protein 3 A,ATAD3A)作为ATAD3家族中的一员,其不仅在正常的生理过程中发挥重要作用,也异常表达于肺癌、乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌等多种肿瘤,并促进肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移和治疗抵抗等多种恶性生物学行为。但ATAD3A在黑色素瘤发生和演进过程中发挥的作用目前尚未见报道。基于此,本研为探讨ATAD3A是否也在黑色素瘤的增殖、侵袭和迁移等恶性生物学行为中发挥作用,通过RNA干扰技术观察沉默ATAD3A基因后对黑色素瘤细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。方法:采用慢病毒介导的方法,将沉默ATAD3A基因慢病毒(sh-ATAD3A)和对照慢病毒(sh-Ctrl)分别感染黑色素瘤A375细胞,嘌呤霉素筛选纯化获得慢病毒感染稳定细胞株。经q RT-PCR(quantitative real-time PCR)和Western blot验证慢病毒干扰效率,构建沉默ATAD3A基因黑色素瘤A375细胞株(sh-ATAD3A)和对照黑色素瘤A375细胞株(sh-Ctrl)。分别应用克隆形成实验、CCK-8检测法、transwell细胞侵袭实验、划痕实验比较两组细胞(sh-ATAD3A和sh-Ctrl组)的增殖、侵袭和迁移能力,探讨沉默ATAD3A基因后对A375细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。同时采用Western blot比较两组细胞自我更新相关蛋白(NANOG,SOX2,OCT4)和侵袭、迁移相关蛋白(MMP2、VIMENTIN、SLUG)的表达水平,进一步探讨沉默ATAD3A基因后对A375细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。结果:1.A375细胞感染慢病毒后,细胞带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP),q RT-PCR和Western blot显示感染沉默ATAD3A基因慢病毒后A375细胞ATAD3A的表达在基因水平(sh-Ctrl:1±0.245,sh-ATAD3A:0.23±0.073,t=5.217,p<0.01)和蛋白水平都相应的下降,成功构建沉默ATAD3A基因黑色素瘤A375细胞株。2.克隆形成实验显示:沉默ATAD3A基因后A375细胞形成的克隆体积变小,克隆形成率降低(sh-Ctrl:43.667±5.033,sh-ATAD3A:22.667±2.517,t=6.464,p<0.05)。3.CCK-8实验显示:沉默ATAD3A基因后A375细胞增殖活性减弱(第4天,sh-Ctrl:1.226±0.069,sh-ATAD3A:0.744±0.051,t=10.146,p<0.01)。Western blot显示:沉默ATAD3A基因后细胞自我更新相关蛋白NANOG,SOX2,OCT4的表达水平降低。4.transwell细胞侵袭实验显示:沉默ATAD3A基因后A375细胞通过transwell小室下室的侵袭细胞减少(sh-Ctrl:535±93.407,sh-ATAD3A:262.67±17.616,t=4.962,p<0.01)。划痕实验显示:沉默ATAD3A基因后A375细胞伤口愈合率减慢(24H,sh-Ctrl:88.304±4.567,sh A-TAD3A:57.197±6.8058,t=6.574,p<0.01)。Western blot显示:沉默ATAD3A基因后细胞侵袭和迁移相关蛋白MMP2、VIMENTIN、SLUG的表达水平降低。结论:沉默ATAD3A基因可减弱黑色素瘤A375细胞的增殖,侵袭和迁移能力。