转录因子RIN对番茄果实成熟和蔗糖代谢的调控机制研究

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果实是开花植物特有的发育器官,孕育着种子的成熟。肉质果实中含有丰富的营养物质,是人类膳食的重要组成部分。果实成熟是一个复杂的生理生化过程,涉及色泽变化、细胞壁降解、糖类、有机酸和芳香化合物合成等生理代谢过程,直接影响果实的采后品质和贮藏性。因此,解析果实成熟的分子调控机制具有重要的理论意义和应用价值。本研究以野生型番茄Ailsa Craig(WT)和rin突变体番茄为材料,运用蛋白质组学、分子生物学和生物化学等实验方法,系统地研究了转录因子RIN对果实成熟和蔗糖代谢的调控机制,并深入解析了受RIN直接调控的VPE3在果实成熟过程中的功能。  1.RIN通过参与果实细胞核蛋白泛素化降解途径调控果实成熟:通过iTRAQ蛋白质组学,分析了WT和rin突变体番茄果实不同成熟时期细胞核蛋白的变化,发现参与泛素化降解途径的蛋白在WT果实成熟过程中上调表达,而在rin突变体中则下调表达。利用染色质免疫共沉淀(ChIP)和凝胶阻滞实验(EMSA),首次证明了SlUBC32和PSMD2是受RIN直接调控的靶基因;VIGS实验进一步证明了SlUBC32参与调控果实的成熟;SWATH实验发现RIN能够调控细胞核蛋白泛素化水平,由此说明RIN是通过参与果实细胞核蛋白泛素化降解途径调控果实的成熟。  2.RIN对果实成熟过程中蔗糖代谢的调控机制:通过测定番茄果实在成熟过程中糖含量变化,发现rin突变体果实的蔗糖、葡萄糖和果糖含量与WT果实有显著差异,暗示RIN可能参与调控果实的蔗糖代谢。对番茄基因组进行搜索,发现38个参与蔗糖代谢的基因,并对这些基因在WT和rin突变体果实中的表达模式进行分析,再利用ChIP和EMSA技术鉴定到17个受RIN调控的靶基因。分析发现RIN通过调控参与蔗糖代谢基因的表达(负调控细胞壁转化酶基因Lin7、Lin8,正调控细胞壁转化酶抑制子基因CIF1;负调控中性转化酶基因NI2、NI4,正调控蔗糖磷酸合酶基因SPSA1、SPSB和果糖激酶基因FKL1、FKL2;正调控液泡转化酶基因VI,负调控细胞壁转化酶抑制子基因VIF),抑制质外体和细胞质中蔗糖的分解,却增强了液泡中蔗糖的分解。转化酶活性测定和VIF的Western blot检测结果与上述转录调控的结果一致。最后,利用iTRAQ蛋白质组学实验解释了VIF对果实成熟的调控机制。  3.VPE3对果实成熟的调控:为了研究RIN的靶基因——VPE3的基因功能,通过番茄遗传转化实验得到了RNAi-VPE3(vpe3)的转基因植株。与WT果实相比,vpe3果实的成熟延迟,乙烯释放量和番茄红素含量降低。利用iTRAQ蛋白质组学,鉴定到ACO1、ACO3、PSY1、CRTISO和PG2A等与成熟相关的蛋白在vpe3果实中均下调表达,这与vpe3果实推迟成熟的表型一致。  这些研究结果为深入认识RIN对果实成熟与品质保持的分子网络和调控机制提供了新的证据。
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