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研究目的:肺癌是世界范围内对人民生命与健康产生危害最大的恶性肿瘤,位列恶性肿瘤致死原因的第一位。近年来,对晚期肺癌患者进行化疗、放疗和靶向等治疗方法均取得了较大的进步,但是,有部分患者仍会出现耐药及疾病进展的状况,肺癌的转移是肿瘤治疗失败和肺癌患者死亡的主要原因,因此,进一步阐明肺癌的转移机制显得尤为重要。最近的研究显示了 miRNA包括miR-9-5p的异常表达可以促进原癌基因或者抑癌基因的表达。在过去的几年中,对于miR-9-5p在肺癌,特别是在非小细胞肺癌中的相关报道的数量还非常少。我们知道,转化生长因子-β(TGF-β)是一种具有多种功能的细胞因子,TGF-β信号传导通路调控细胞的生长、分化、凋亡、迁移和细胞外基质的生成,具有抑癌和致癌活性,在癌症生成中起到非常重要的作用。但TGF-β的生物作用必须与TGFBR相结合后才能发挥,其与TGFBR2有着高度亲和力,TGF-β与TGFBR2相结合,完成该过程后将与TGFBR1各以二聚体形式进行复合,从而形成异四聚体复合物,TGFBR2可以通过转磷酸化的方式,磷酸化TGFBR1甘氨酸一丝氨酸区,进而活化TGFBR1,TGFBR1活化以后构型会发生变化,从而激活下游的Smad、MAPK通路。TGFBR2蛋白表达发生异常将导致TGF-β信号传导紊乱,对细胞生长分化失去控制,进而促进癌症的发生与发展。miR-9-5p被报道可以直接调节肺上皮细胞中TGFBR2的表达,但机理不详。鉴于此,在本研究中我们将探讨miR-9-5p在肺癌组织及细胞系中的表达、与肺癌生长和转移的关系及其机制的研究。研究方案:1.探讨miR-9-5p RNA在人非小细胞肺癌组织、周围正常肺组织中的表达,分析miR-9-5p与非小细胞肺癌临床病理特征的关系,并进一步探讨miR-9-5p在非小细胞肺癌中的临床意义。2.通过脂质体2000介导miR-9-5p模拟物载体质粒进入人肺腺癌A549细胞株及人肺鳞癌SK-MES-1细胞株,观察过表达miR-9-5p后对人肺腺癌A549细胞株及人肺鳞癌SK-MES-1细胞株增殖、凋亡相关的影响。3.探讨高表达miR-9-5p在A549和SK-MES-1细胞中抑制肺癌细胞迁移和转移的机制。研究内容:1.对30例经HE染色证实为非小细胞肺癌的肺癌组织标本及正常组织标本进行RT-PCR检测结果表明:与正常组织标本相比,miR-9-5p在肺癌样本组织中RNA水平明显下降(P<0.05),差异有统计学显著性。且有淋巴结转移NSCLCs miR-9-5p水平均显著低于无淋巴结转移(P<0.05)。2.在未处理前测定的4株细胞的RT-PCR结果显示了 miR-9-5p RNA的表达量,A549,SK-MES-1明显低于BEAS-2B细胞系,P<0.05;转染miR-9-5p模拟物后,细胞划痕实验、MTT法和Transwell小室法结果提示了显示细胞侵袭、增殖能力显著降低。3.通过 Targetscan 软件来预测了 TGFBR2 3’UTR 是 miR-9-5p 与 TGFBR1 和TGFBR2mRNA潜在的结合位点。将假定的野生型和突变的3’ UTR克隆到荧光素酶报告基因载体上,然后将miR-9-5p转染到这两个报告载体中,结果表明,miR-9-5p转染能够明显降低含WT3’UTR报告载体的荧光素酶活性,相反,含3’ UTR突变载体的荧光素酶活性未降低。Western blot试验提示了 miR-9-5pRNA可以直接绑定在TGFBR2野生型的3 ’ UTR进行绑定并可以抑制TGFBR2的表达,进一步能够降低了 Smad2和Smad3蛋白的磷酸化和活化。主要结论:1.miR-9-5p在人肺癌组织中的表达相比与正常组织中表达明显下降。有淋巴结转移肺癌标本相比与无淋巴结转移的肺癌标本中miR-9-5p水平显著下降。提示miR-9-5pRNA水平与肺癌转移能力成负相关。2.miR-9-5p基因可调控体内外肺癌细胞迁移和增殖,通过脂质体2000包埋miR-9-5p构建载体,转载至肺A549细胞系和SK-MES-1细胞系中,可抑制肺癌A549细胞系和SK-MES-1的迁移和增殖。3.miR-9-5p抑制体内外肺癌细胞的迁移和增殖可能是通过抑制TGFBR2通路实现的。