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喉癌是头颈部常见恶性肿瘤，目前手术治疗是其主要治疗手段。然而，近二十年来喉癌患者的五年生存率并无明显提高；而且，晚期喉癌的全喉切除给患者留下严重功能障碍，严重影响了患者的生活质量。如何根治喉癌的同时更好的保护喉功能，是目前研究的主要方向。随着分子生物学和基因工程技术的发展，肿瘤的基因治疗受到越来越多的重视。目前常用的基因载体主要有病毒载体和非病毒载体两大类。然而，不论病毒载体还是非病毒载体，它们在肿瘤基因治疗中都缺乏良好的靶向性。研究表明，基因载体在靶部位聚集缓慢以及靶部位载体浓度过低是导致基因传输及表达效率不高的主要原因。磁性纳米药物作为一种新的非病毒基因载体，在肿瘤的靶向性上具有良好的优势。磁性纳米药物对肿瘤的靶向性主要有被动靶向、磁靶向和分子靶向。研究表明，直径在100nm以下的纳米颗粒在细胞的吞噬作用下，磁性纳米载体携带基因治疗分子进入细胞并释放这些分子，可以实现安全有效的靶向性基因治疗作用。
叶酸受体是一种肿瘤相关抗原，在正常组织中很少表达，而在多种肿瘤组织中过度表达，如乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢非黏液腺癌、鼻咽癌等。基于叶酸受体表达的这种组织分布特点，以及叶酸受体与叶酸的高度亲和性，叶酸可作为肿瘤治疗的一个靶点，是目前肿瘤治疗研究的热点。我们课题组前期研究已经成功制备了叶酸靶向磁性纳米药物，并且在鼻咽癌的治疗研究中取得良好效果。本研究拟在此基础上构建叶酸靶向载MMP-2反义寡核苷酸磁性纳米复合物，通过体内外实验研究具对喉癌的基因治疗效果。
本研究包括下述四个部分：
第一部分，采用免疫组织化学和免疫荧光方法分别研究叶酸受体在喉癌组织和Hep-2细胞株中的表达情况。结果显示81.3％(13/16)的喉癌组织标本表达叶酸受体，晚期(Ⅲ+Ⅳ期)喉癌组织中叶酸受体阳性率高于早期(Ⅱ期)喉癌，有淋巴结转移者叶酸受体阳性率高于无淋巴结转移者，差异均有统计学意义(p＜0.05)；叶酸受体表达与性别、年龄等因素无明显相关。Hep-2细胞膜上强阳性表达叶酸受体，阳性细胞数＞90％。这些结果提示以叶酸受体作为靶点的药物可用于喉癌的治疗。
第二部分，采用免疫组织化学方法研究基质金属蛋白酶-1(MMP-1)和-2(MMP-2)在喉癌组织和Hep-2细胞株中的表达情况。结果显示喉癌组织中MMP-1和MMP-2阳性表达率分别为76.7％(23/30)和80％(24/30)，其表达程度与喉癌的局部侵袭和淋巴转移具有密切关系。这些结果为我们进行喉癌的MMP-2基因治疗提供了分子生物学基础。
第三部分，将醛基化海藻酸钠改性的叶酸靶向磁性纳米载体与MMP-2反义寡核苷酸耦联，成功制备了载MMP-2反义寡核苷酸的叶酸靶向磁性纳米复合物。采用普鲁士蓝铁染色、MRI成像技术和透射电镜等检测这种磁性纳米复合物对喉癌细胞的体内和体外靶向性能。结果显示该纳米药物对喉癌Hep-2细胞和裸鼠皮下移植瘤有良好的靶向性。
第四部分，通过体内、外实验研究了叶酸靶向载MMP-2反义寡核苷酸的磁性纳米复合物对喉癌的基因治疗效果。体外实验中，RT-PCR、Western-blot、Matrigel体外侵袭实验显示，该纳米复合物能够显著减少Hep-2细胞中MMP-2的表达，并抑制Hep-2细胞的侵袭能力。MTT法显示其对Hep-2细胞的增殖能力没有影响。体内实验显示叶酸靶向载MMP-2反义寡核苷酸磁性纳米复合物治疗组的裸鼠移植瘤平均瘤重较对照组有所减少，抑瘤率为10.06％，但是差异无统计学意义(P＞0.05)。我们考虑其原因主要是肿瘤是一种涉及多基因突变的疾病，单纯抑制MMP-2墓因可能无法抑制肿瘤生长，或者其影响程度较小，需要更大样本量才能检测出来。
本研究的主要创新点：
1.初步确定了叶酸受体在喉癌组织和Hep-2细胞株中的表达情况；
2.成功制备了叶酸靶向载MMP-2反义寡核苷酸磁性纳米复合物，通过体内、外实验证明该复合物对喉癌有良好的靶向性和基因治疗效果。