裂殖壶菌培养基优化、菌种选育及遗传转化体系的研究

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二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)是一种n-3多不饱和脂肪酸。自上世纪Dyerberg发现DHA对心血管病等有重要作用以来,国内外学者发现DHA在婴幼儿神经系统的发育、保护视力、抗癌、抗炎等方面也有重要的作用。裂殖壶菌(Aurantiochytrium limacinum)作为一种理想的工业化DHA生产菌,其DHA含量可达到细胞干重的40%左右,近年来受到国内外学者的关注。本论文从培养条件优化、菌种选育、功能基因克隆以及转基因方法等方面对裂殖壶菌开展研究,为提高裂殖壶菌的生物量和DHA含量奠定基础。  本文以裂殖壶菌Aurantiochytrium limacinum为研究对象,以MnCl2·4H2O, ZnSO4·7H2O,CoCl2?6H2O为三个因子,探讨了微量元素对裂殖壶菌生长及DHA含量的影响。正交实验结果显示裂殖壶菌的生物量与DHA含量呈正相关关系, Co2+对裂殖壶菌的生物量及DHA含量影响最大,其次是Zn2+和Mn2+。正交实验的理论最优组合与实验最优组合一致,为MnCl2·4H2O:32mg/L;ZnSO47H2O:30mg/L;CoCl2·6H2O:1.2mg/L。在添加了微量元素的裂殖壶菌配方中,裂殖壶菌生物量提高了61.38%,DHA含量提高了47.85%。  然后,本文以裂殖壶菌Aurantiochytrium limacinum OUC168为出发菌株,经亚硝基胍诱变及喹禾灵筛选,筛选出性状优良的突变菌株 Aurantiochytrium limacinum OUCB1。该菌株的生物量达到7.33 g·L-1·d-1,比出发菌株提高65.09%;DHA含量达到18.05%,提高49.92%。以菌株、培养基中葡萄糖、谷氨酸钠、酵母提取物含量这四个因素设计正交实验,测定不同菌株在不同培养条件下生物量、DHA含量和乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)活性并进行相关性分析。结果显示,生物量、DHA含量和ACCase活性受培养基各成分变化的影响较小,而与菌株因素关系密切,ACCase活性与生物量、DHA含量存在正相关关系。同时我们得到了突变株OUCB1的最佳培养条件:葡萄糖70 g/L、谷氨酸钠20 g/L、酵母提取物20 g/L。突变株OUCB1的经济性状优于出发菌株,具有潜在的应用价值。  聚酮合酶(PKS)是裂殖壶菌多不饱和脂肪酸合成的一个关建酶,在DHA合成途径中起着尤为关键的作用。本文克隆得到了pks2的基因全长,共6105bp,不含有内含子。这6105个碱基编码一个完整的蛋白,含2034个氨基酸,其氨基酸序列共包含4个保守结构域,分别是KS,AT和FabD酶域,其中KS酶域在氨基酸序列上重复出现,但是2个KS酶域并不相同,可能与催化不同的反应底物有关。同时我们在裂殖壶菌中发现了FAS合成途径中的FabD酶域,他与PKS合成途径中的AT酶域功能大体一致。本研究首次克隆得到裂殖壶菌pks2基因全长,为从分子水平研究裂殖壶菌的DHA合成途径奠定了基础,并为裂殖壶菌的基因改造提供了有用的基因信息。  最后,我们将Cre/loxP位点特异性重组系统应用到了裂殖壶菌中,将含有loxP位点、氯霉素标记和绿色荧光蛋白的p18SCPGC载体转入裂殖壶菌OUC168中,得到能在含有氯霉素培养基上生长的且能够发出绿色荧光的裂殖壶菌OUC_EG。通过再次转入pSH65质粒,利用pSH65质粒Cre重组酶的作用将loxP位点中间的氯霉素标记基因切除,得到没有抗生素抗性,但是仍能发出绿色荧光的裂殖壶菌OUC_CG。通过PCR检测验证了裂殖壶菌OUC_CG中氯霉素标记基因已成功切除;通过荧光检测和Southern杂交鉴定,验证了裂殖壶菌OUC_EG与OUC_CG中的绿色荧光蛋白基因未受到氯霉素标记基因切除的影响,始终能够表达。Cre/loxP位点特异性重组系统在裂殖壶菌中的成功应用为裂殖壶菌的基因改造,获得无抗生素标记的裂殖壶菌菌种奠定了实验基础。
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