论文部分内容阅读
【目的】本研究旨在探索Ep300(巴豆酰基转移酶)在卵丘细胞(CCs)成熟过程中介导的EGFR(表皮生长因子受体)Kcr(巴豆酰基化修饰)的作用以及相关的调控分子机制。【方法】1)检测Ep300对CCs增殖凋亡的影响:我们采用siRNA技术敲低Ep300的表达和特异性激活剂CTPB激活Ep300,Dot Blot(点杂交)检测细胞总Kcr的水平;其次,在Ep300低表达或激活的情况下,采用Annexin V-FITC/PI染色(细胞凋亡双染色)以及Western Blot检测凋亡标志物Fox-01A、Fox-03A验证Ep300是否抑制细胞的凋亡,同时,CCK8实验(细胞增殖实验)检测Ep300是否促进细胞增殖。2)筛选Ep300的底物并验证:对两组Kcr修饰的靶蛋白及位点取交集,KEGG通路分析,结果是巴豆酰化修饰蛋白与卵母细胞减数分裂相关,其中EGFR做为卵丘调控卵母细胞的关键因子可也被Kcr修饰,可能是Ep300的底物。首先,r-EGFR(重组EGFR)和Kcr-CoA(巴豆酰基-辅酶A)共孵育验证EGFR是否存在Kcr修饰,免疫共沉淀(Co-IP)验证内源EGFR是否存在Kcr修饰;其次,结合Co-IP及siRNA实验,验证Ep300是否与EGFR结合、并参与调控EGFR的Kcr修饰;最后,初步探索Nacr(巴豆酸钠,外源性巴豆酰化激活剂)对siEp300不同情况下Kcr修饰对EGFR以及p-EGFR(磷酸化-表皮生长因子受体)表达水平的影响。3)探索EGFR的Kcr上调EGFR和p-EGFR表达的分子机制以及对下游通路的影响。首先,验证Kcr修饰上调EGFR表达的分子机制:(1)转录水平验证:RT-PCR检测EGFR不同情况下(Nacr vs cont.)的表达情况;(2)合成水平验证:使用蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺(CHX)处理HEK 293T(Nacr vs cont.),Western Blot检测EGFR表达情况;(3)降解水平验证:使用蛋白酶体抑制剂MG-132处理HEK 293T(Nacr vs cont.),Western Blot检测EGFR表达情况。其次,验证Kcr修饰上调p-EGFR表达的分子机制:结合Uniprot数据库分析显示,EGFR的Kcr位点也是ATP结合位点之一,由此我们将r-EGFR与不同浓度Kcr-CoA共培养,然后与ATP类似物TNP-ATP进行孵育,检测Kcr修饰对EGFR和ATP的结合能力的影响。进一步检测Kcr修饰对内源EGFR与ATP结合的影响:予以HEK 293T不同处理(Nacr vs cont.),4 h后IP EGFR,将所得的产物与TNP-ATP共同孵育,检测内源性Kcr修饰对EGFR和TNA-ATP的结合能力的影响。最后检测Ep300介导的Kcr修饰对于EGFR下游信号通路的影响,在CCs和HEK 293T中,分别予以Nacr和siEp300处理,Western Blot检测EGFR下游分子p-ERK、ERK、p-AKT、AKT的表达情况。【结果】1)siEp300后Kcr表达下降且凋亡标志物Fox-01A、Fox-03A升高,CTPB激活Ep300后Kcr表达升高且凋亡标志物Fox-01A、Fox-03A下降,Annexin V-FITC/PI染色、CCK8实验表明Ep300促进CCs及HEK 293T的增殖,抑制凋亡;2)根据数据库分析,EGFR可能是Ep300的底物。首先内源性及外源性EGFR均可被Kcr修饰,并且EGFR的Kcr修饰由Ep300介导,且Kcr修饰能上调EGFR和p-EGFR的表达;3)验证了Kcr修饰能抑制EGFR降解,上调EGFR的表达,与此同时,增强EGFR与ATP的结合能力,从而上调p-EGFR的表达;进一步的实验证实,EGFR的Kcr修饰能激活其下游通路p-ERK、p-AKT的表达。【结论】Ep300介导EGFR的Kcr修饰,上调CCs的EGFR及p-EGFR的表达,激活EGFR通路促进卵母细胞的体外成熟,为卵母细胞的体外成熟提供新的策略。