【摘 要】
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砷(Arsenic,As)是一种具有致癌性的类金属,可对机体多个系统造成不可逆损伤。环境毒素深刻影响野生动物和鱼类,在水环境中,砷污染通过影响水生生物的生殖健康以及幼体发育,对相关产业产生了重大影响。本文选用多种鲤科鱼类细胞系,探究砷中毒的毒理学机制。锌(Zinc,Zn)是机体必须微量元素,在细胞稳态和免疫反应中发挥着关键作用。研究发现锌可以在哺乳动物、两栖动物中拮抗多种重金属引起的器官毒性。然而
【基金项目】
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中央高校基本科研业务费项目(博士研究生自主创新基金项目)(Grant 2572020AW028);
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砷(Arsenic,As)是一种具有致癌性的类金属,可对机体多个系统造成不可逆损伤。环境毒素深刻影响野生动物和鱼类,在水环境中,砷污染通过影响水生生物的生殖健康以及幼体发育,对相关产业产生了重大影响。本文选用多种鲤科鱼类细胞系,探究砷中毒的毒理学机制。锌(Zinc,Zn)是机体必须微量元素,在细胞稳态和免疫反应中发挥着关键作用。研究发现锌可以在哺乳动物、两栖动物中拮抗多种重金属引起的器官毒性。然而,目前关于砷和锌在鲤科鱼体内的互作机制尚不完全清楚。本研究从以下几个角度对鲤科鱼的砷中毒机制以及锌的缓解效果展开研究:1.IRE1信号通路介导的保护性自噬抵抗砷诱导草鱼肝细胞凋亡基于转录组测序的KEGG富集分析显示,在草鱼肝细胞系L8824细胞中,砷显著影响了内质网(ER)应激和细胞自噬通路(p<0.01)。验证实验显示,三种内质网驻留跨膜蛋白,激酶PERK和IRE1以及转录因子ATF6的蛋白表达水平在砷处理24小时后显著增加(p<0.01)。另外,ER应激下游的促凋亡蛋白(CHOP、GADD34和PARP)以及荧光染色结果共同表明,细胞凋亡水平在砷处理24小时后显著增加(p<0.01)。而ER应激特异性抑制剂4-PBA显著缓解砷导的上述ER应激和细胞凋亡指标,提高了细胞存活率(p<0.01)。结果还表明,本模型中的自噬是细胞抵御砷毒性的保护性反应。此外,我们发现JNK抑制剂下调了自噬以及c-Jun与Beclin1启动子的相互作用。而且,si-IRE1可以抑制砷处理的L8824细胞中IRE1、p-ASK1和p-JNK的表达,伴随着自噬水平的显著抑制(p<0.01)。总之,这些结果表明砷可以诱导L8824细胞发生ER应激依赖的细胞凋亡,IRE1通过激活JNK信号诱导保护性自噬。2.通过靶向抑制铁死亡减轻砷诱导的斑马鱼细胞毒性基于转录组测序的KEGG富集分析显示,在斑马鱼成纤维细胞系ZF4细胞中,砷诱导的差异基因显著富集在细胞凋亡、细胞周期阻滞和自噬过程(p<0.01)。验证实验表明,As3+可以时间依赖性地(24小时和48小时)诱导并增强ZF4细胞凋亡、细胞周期阻滞和自噬性死亡,而仅在48小时诱导了铁死亡。于是我们进一步剖析Alox12(12-脂氧合酶)和NCOA4(铁蛋白重链1(FTH1)的自噬降解受体)是否为As3+暴露24小时至48小时的铁死亡检查点。在As3+处理ZF4细胞24h时,pc DNA3.1-NCOA4显著降低了FTH1的富集,并导致细胞Fe2+的泄漏(p<0.01)。而且,pc DNA3.1-Alox12/NCOA4进一步提高了细胞死亡率和ROS生成,同时,MDA、PTGS2a、CHAC1的增加和GPx4的过量消耗表明铁死亡的启动。而当ZF4暴露于As3+48小时后,铁死亡被显著激活,而si-Alox12、si-NCOA4或Fer-1与As3+共同处理均抑制铁死亡并提高细胞存活率(p<0.05或p<0.01)。本部分研究揭示了Alox12和NCOA4在砷诱导的铁死亡中的作用,为砷中毒的调控和靶向治疗提供了证据。3.砷诱导鲤鱼中性粒细胞的免疫毒性不同浓度的As3+(10、20和40μM)以剂量依赖的方式抑制鲤鱼中性粒细胞的活力,且伴随着细胞ROS和MDA水平的上升和SOD、CAT和GSH的显著降低。同时,中性粒细胞迁移(CXCa和CXCR1)、吞噬(TLR4和CR3)功能相关指标均被As3+抑制,其中40μM组变化最为显著(p<0.01),且伴随着IL-1β和TNF-α的显著上升(p<0.01)。另外,SYTOX Green和Hoechst双染,组蛋白3(H3)和髓过氧化物酶(MPO)水平检测证明中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)释放量以砷浓度依赖方式增加。而这些NETs生成增加指标被JAK抑制剂Ruxolitinib所显著抑制。这表明As诱导的鲤鱼中性粒细胞NETs形成是一种JAK/STAT依赖的细胞过程。4.锌对鲤鱼慢性砷中毒的保护作用本部分研究以鲤鱼为模式生物,评估了As3+(2.83mg/L)对鲤鱼的毒性,以及Zn2+(1mg/L)的缓解作用。研究结果表明,砷可在鲤鱼脑、肝、肠组织中显著累积,并导致该部位显著的病理学变化、氧化性损伤和细胞凋亡反应,同时伴有区域性肝-肠轴的炎症、肠道通透性增加以及肝脏脂质代谢紊乱。而上述砷对鲤鱼造成的中毒反应均可被锌部分或显著缓解。综上所述,砷作为活性氧诱导剂,可导致不同鲤科鱼细胞表现出氧化应激及其级联损伤的表型,如内质网应激、凋亡、铁死亡、炎症等。锌是机体自由基消除系统中多种重要酶的组成元素,在鲤鱼砷中毒模型中显示出显著的抗炎、抗凋亡、免疫调节和脂质调节功能。本课题为进一步研究及现场使用锌防治砷中毒提供科学依据。
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