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手性苯甘氨醇在制药上是一类非常重要的化合物,可作为手性砌块用于合成如神经营养剂、抗生素、酶抑制剂等药物。现有的手性苯甘氨醇化学合成方法通常存在催化剂昂贵、选择性不理想、生产工艺繁琐、产率低等缺点。生物催化因催化效率高、专一性强、选择性高、对环境友好而成为手性苯甘氨醇合成较理想的方法之一。然而,目前通过生物催化来合成手性苯甘氨醇仍存在产物收率低和原料主要以石油基来源化合物为主的缺点,使得现有方法绿色可持续性降低。因此,手性苯甘氨醇绿色可持续合成仍面临巨大挑战。本研究报道了一种新颖的模块化级联生物催化体系,可有效将生物基L-苯丙氨酸转化为手性苯甘氨醇,为手性苯甘氨醇的绿色可持续合成提供了一条新途径,并为规模化生物催化生物基L-苯丙氨酸制备手性苯甘氨醇提供了理论基础。首先,通过设计的级联生物催化体系筛选得到各步反应所需要的酶,分别为催化L-苯丙氨酸(L-PA)合成反式肉桂酸的苯丙氨酸解氨酶PAL;催化反式肉桂酸合成苯乙烯的阿魏酸脱羧酶Fdc1和苯丙烯酸脱羧酶Pad1;催化苯乙烯合成氧化苯乙烯的NADH依赖型的烯烃单加氧酶SMO;催化氧化苯乙烯合成(S)-1-苯基-1,2-乙二醇的环氧化物水解酶Sp EH;催化(S)-1-苯基-1,2-乙二醇合成2-羟基苯乙酮(2-HAP)的NAD+依赖型的醇脱氢酶Go SCR;催化2-HAP合成(S)-或(R)-苯甘氨醇的(R)-ω-转氨酶MVTA和(S)-ω-转氨酶BMTA;在合成(R)-苯甘氨醇的过程中,为了使胺供体L-丙氨酸(L-Ala)循环再生,本研究选择NADH依赖型的丙氨酸脱氢酶Ala DH催化丙酮酸合成L-Ala,同时选择NAD+依赖型的葡萄糖脱氢酶GDH与Ala DH构成NAD+/NADH循环再生体系。为了验证级联生物催化体系的可行性,首先在体外考察了组合6种酶(PAL/Fdc1/Pad1/SMO/Sp EH/Go SCR)一锅煮转化L-PA合成2-HAP的性能,在未对反应条件进行优化的情况下,2-HAP的得率可达99%以上。其次进一步考察了组合7种酶(PAL/Fdc1/Pad1/SMO/Sp EH/Go SCR/MVTA或BMTA)一锅煮直接转化L-PA合成手性苯甘氨醇,产物得率可达66%以上,ee>99%。其次,通过构建多种共表达质粒成功在大肠杆菌细胞中共表达6种酶(PAL/Fdc1/Pad1/SMO/Sp EH/Go SCR),最终确定E.coli(RFP-DEA-CGS)作为细胞模块1用于后续实验,并对E.coli(RFP-DEA-CGS)催化L-PA合成2-HAP的反应条件进行初步优化,确定反应最适p H为7.5、最适温度为25 oC、最适比例L-PA:葡萄糖=2:1、最适细胞浓度为25 g cdw/L。利用重组菌E.coli(RFP-DEA-CGS)在不添加任何辅因子NAD+/NADH的条件下,成功催化L-PA(10-50 m M)转化为2-HAP,得率高达99%。最后,成功构建了可表达MVTA和可共表达BMTA、Ala DH和GDH的2种重组大肠杆菌细胞模块,可高效催化2-HAP分别合成(S)-或(R)-苯甘氨醇。最终确定E.coli(MVTA)作为细胞模块2和E.coli(EB-DGA)作为细胞模块3用于后续实验。将细胞模块1(E.coli(RFP-DEA-CGS))和细胞模块2(E.coli(MVTA))组合构成混合菌群(简写为混合菌群1-2),以L-PA(20 m M)为模式底物对反应条件进行优化,确定反应最适p H为7.5、最适温度为25 oC、最适比例L-PA:葡萄糖=2:1、最适比例L-PA:苯乙胺=1:1.5,最适比例E.coli(RFP-DEA-CGS):E.coli(MVTA)=20:15 g cdw/L。在不添加辅因子NAD+/NADH的条件下,成功催化L-PA(10-50 m M)合成(S)-苯甘氨醇,得率高达99%,ee>99%。细胞模块1(E.coli(RFP-DEA-CGS))和细胞模块3(E.coli(EB-DGA))组合构成混合菌群(简写为混合菌群1-3),以L-PA(20 m M)为模式底物对反应条件进行优化,确定反应最适p H为7.5、最适温度为25 oC、最适比例L-PA:葡萄糖=1:1、最适比例L-PA:L-Ala=1:20、最适比例L-PA:NH3/NH4Cl=1:7.5,最适比例E.coli(RFP-DEA-CGS):E.coli(MVTA)=15:20 g cdw/L。在不添加辅因子NAD+/NADH的条件下,成功催化L-PA(10-30 m M)合成(R)-苯甘氨醇,得率高达99%,ee>99%。并将级联催化规模扩大至100 m L,利用混合菌群1-2或1-3催化L-PA(20 m M)制备(S)-或(R)-苯甘氨醇,产率分别为71.0%和80.5%,ee>99%,时空得率分别为5.19 g/L.d和4.42 g/L.d。