论文部分内容阅读
近半个世纪以来,不孕症的发生率在不断提高,已经达到10-15%,已成为全球性的社会问题。其最有效治疗手段是上个世纪70年代发展的人类辅助生殖技术,即俗称的试管婴儿。虽历经30多年的努力,但试管婴儿的成功率也只达到30-40%。除了年龄外,还没有预知妊娠结局明确的早期标识物,所以从多方位多角度寻找妊娠失败的原因成了当前的研究热点。除了环境因素的影响外,遗传因素、内分泌和细胞因子的研究也成为研究重点。近来发现抑癌基因P53可通过调节宫腔内的LIF影响雌性胚胎植入,在雌性生殖方面起着重要作用。作为转录因子,TP53通过调节多个基因的表达,在细胞周期调控、基因组稳定性维持、诱导细胞分化和凋亡中都有重要的作用。TP53codon72多态是重要的功能性多态位点,TP53codon72位点碱基G-C的改变造成了Arg-Pro的氨基酸替换,使P53蛋白的生物学活性发生改变。研究表明TP53codon72多态与不孕、子宫内膜异位症和宫腔内的LIF表达都有相关性。MDM2是TP53通路上的重要负调控因子,它的重要功能多态MDM2SNP309涉及到MDM2生物活性的改变,最近的研究表明其与稽留流产和不孕症的发生具有相关性。人类胚胎植入过程也受女性生殖内分泌的调控,研究发现FSH/LH比值在IVF治疗中具有重要的地位。由于卵巢功能下降的早期FSH升高比LH早,而最初的下降主要是卵子质量而非数量的下降,所以FSH/LH比值对于预测卵巢功能比单纯的FSH更有价值,但FSH/LH比值能否预测IVF治疗结局还不确定。LIF是一种具有多种生物学效应的细胞因子,卵泡液中存在的LIF与促排卵和卵子发育密切相关。关于卵泡液LIF水平是否与个体基因型和妊娠结局具有相关性还未确定。为此本文从遗传、内分泌和细胞因子角度出发,寻找不孕症的发生和治疗结局的影响因素。本文通过分析男性和女性不孕人群的TP53codon72SNP多态和MDM2SNP309的分布频率,分析它们之间的相关性；测定了IVF-ET患者取卵周期卵泡液的LIF浓度,寻找卵泡液LIF与IVF治疗结局的关系；测定了基础FSH/LH比值,寻找临床妊娠的早期指示因子。研究对象为2009年9月至2012年9月就诊于昆明医科大学第二附属医院生殖医学科并进行IVF-ET治疗的年龄小于40岁的患者,排除染色体异常引发的不孕。包括1450个女性患者和250个具有正常生育史的女性对照,83个男性不育患者和401个正常对照。所以样本收集均经过患者知情同意。收集外周血提取DNA采用PCR-RFLP方法确定基因型。共收集326个IVF-ET患者的卵泡液采用酶联免疫方法测定卵泡液LIF水平。收集1051例患者的第三天血清采用化学发光免疫法测定基础FSH和LH浓度。结果发现TP53codon72多态基因型Pro/Pro、Pro/Arg和Arg/Arg在女性不孕症和对照组的分布频率分别为23.52%vs.20.80%、51.52%vs.53.20%和24.97%vs.26.00%,表明Pro等位基因没有增加不孕症发生的风险(OR=1.08,95%CI:0.79-1.31, p=0.44);Pro/Pro基因型在子宫内膜异位症患者和对照组中的分布频率为28.10%vs.20.08%,说明Pro/Pro基因型增加了子宫内膜异位症的发生风险(OR=1.56,95%CI:1.02-2.53,p<0.05); Pro等位基因在妊娠阳性和未妊娠组的分布频率为52.10%vs.47.40%,表明Pro等位基因降低了妊娠失败的风险(OR=0.83,95%CI:0.71-0.96, p=0.01); MDM2SNP309多态基因型T/T、T/G和G/G在不孕症组和对照组的分布频率分别为22.08%vs.18.40%、54.55%vs.55.60%和23.38%vs.16.00%,表明T等位基因没有增加不孕症发生的风险(OR=1.06,95%CI:0.81-1.34,p=0.31),等位基因T在多囊卵巢综合症患者和对照的分布频率为54.00%vs.46.90%,增加了多囊卵巢综合症发生的风险(OR=1.35,95%CI:1.02-1.80, p=0.04);而MDM2SNP309T等位基因在妊娠阳性组和对照组的分布频率为49.60%vs.48.10%,T等位基因并没有增加妊娠失败的风险(OR=0.93,95%CI:0.82-1.14,p=0.41); TP53codon72和MDM2SNP309多态联合分析表明,基因型组合Arg/Arg G/G的妊娠率为显著低于其他基因型组合的平均妊娠率(27.91%vs.39.27%,p=0.03), Arg/Arg G/G增加了IVF妊娠失败的风险；考虑年龄因素对不孕及妊娠结局的影响,对年龄进行了分层分析,结果表明年龄因素在TP53codon72和MDM2SNP309多态与不孕症和治疗结局关系中的混杂作用不明显。TP53codon72多态基因型Pro/Pro、Pro/Arg和Arg/Arg在中国男性不育症和对照组的分布频率分别为28.90%vs.22.40%、42.20%vs.53.40%和28.90%vs.24.20%,这表明Pro等位基因没有增加男性不育症的发生风险(OR=1.04,95%CI:0.74-1.45,p=0.84); MDM2SNP309多态基因型T/T、T/G和G/G在不孕症组和对照组的分布频率为20.50%vs.23.80%、57.80%vs.54.19%和21.70%vs.21.91%,说明明T等位基因没有增加男性不育症发生的风险(OR=1.01,95%CI:0.76-1.80,p).71).考虑年龄因素对男性不育症和治疗结局的影响,进行了年龄分层分析,结果表明年龄因素的混杂作用不明显。具备正常卵巢功能并且年龄小于35岁的女性不孕人群,基础FSH/LH比值<2的患者妊娠率显著高于FSH/LH比值≥2患者的妊娠率(45.73%vs.38.65%, p=0.04); FSH/LH<2联合TP53codon72Pro等位基因降低了妊娠失败的风险(OR=0.75,95%CI:0.62-0.91,p=0.01)。MDM2SNP309在不同FSH/LH比值组中,不同妊娠结局患者中的分布频率未见异常。综上所述,TP53codon72和MDM2SNP309多态与中国人群不孕症及其治疗结局的相关性分析表明TP53codon72多态与子宫内膜异位症的发生和IVF治疗结局具有相关性；MDM2SNP309多态与多囊卵巢综合症的发生相关；基因型组合Arg/Arg G/G与IVF治疗结局失败相关；FSH/LH<2及FSH/LH<2联合TP53codon72Pro等位基因与IVF治疗结局相关。研究结果对于提高不孕症的诊治效率具有指导意义,但由于当前样本量、候选基因数量和缺少环境因素等的限制,多种族地域的大样本量筛查及妊娠机理研究还亟待开展。