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课题背景:OA是医学临床最常见的骨关节疾病,为目前导致中老年人残障的第二大病因(仅次于心脑血管疾病)。OA分为原发性(特发性)和继发性两类。研究表明,原发性OA是关节软骨损伤与修复失衡所致;MSCs具有自我更新和多向分化潜能,在一定条件下被激活后,可大量增殖并向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等方向分化,在维持组织自身稳定和修复病变组织中起着至关重要的作用;bFGF和TGF-β1具有显著的促MSCs增殖的作用;核结合蛋白SOX6和SOX9是诱导MSCs成软骨分化相关基因表达的必要因子,是成软骨分化的关键开关。新近研究发现正常人和原发性OA患者关节软骨内存在具有MSCs特性的MPCs,且原发性OA关节软骨内MPCs的数量较正常关节软骨内MPCs增多。而原发性OA和正常人关节软骨内MPCs的生长和增殖特性及其成软骨、成骨和成脂分化能力,以及在原发性OA发生和发展中起的作用如何;bFGF和TGF-β1对关节软骨MPCs的促增殖作用,SOX6和SOX9对MPCs的成软骨分化作用,目前尚未见相关研究报道。因此,观察比较原发性OA及正常人关节软骨MPCs的生长和增殖特性及其成软骨、成骨和成脂分化能力及其在关节软骨退变及原发性OA发生和发展中的作用,可为探讨关节软骨退变及原发性OA发病的机制提供新思路;同时观察相关生物因子对OA关节软骨MPCs的促增殖和成软骨分化的作用,可为通过调控关节软骨MPCs以防治原发性OA提供理论依据。目的:观察比较原发性OA及正常人关节软骨MPCs的生长和增殖特性及其成软骨、成骨和成脂分化能力,明确关节软骨MPCs在原发性OA发病中的重要作用;观察bFGF和TGF-β1对原发性OA关节软骨MPCs的促增殖作用,以及SOX6和SOX9对其MPCs的成软骨分化作用,为通过调控关节软骨MPCs以防治原发性OA提供理论依据。方法:1.采用改良酶消化分离法观察比较原发性OA及正常人关节软骨单位湿重的细胞含量。采用免疫磁珠法,以CD105、CD166为标志物,分别于原代培养原发性OA及正常人关节软骨细胞中,分选其关节软骨MPCs,并分别计算其阳性细胞比率和存活率,流式细胞仪检测分选细胞表面的分子表型,对比观察原发性OA及正常人关节软骨MPCs的细胞数量、生长特性、细胞增殖的变化。2.观察原发性OA及正常人关节软骨MPCs成软骨(微团培养)诱导分化后的细胞形态变化,TB、Ⅱ型胶原、aggrecan染色,GAG含量及Ⅱ型胶原mRNA表达;成骨(单层传代培养)诱导分化后细胞形态变化,钙结节染色,ALP活性及BGPmRNA表达;成脂(单层传代培养)诱导分化后细胞形态变化,油红染色,油红染色阳性细胞比率及TG含量。3.采用MTT法测定不同浓度bFGF和TGF-β1单独或联合作用下对原发性OA关节软骨MPCs的增殖作用。分别以pAdTrack-CMV-SOX6、SOX9腺病毒穿梭质粒构建SOX6、SOX9基因,并感染原发性OA关节软骨MPCs,比较基因感染组和未感染组成软骨诱导分化后,TB、II型胶原以及II型胶原mRNA表达的变化。结果:1.原发性OA关节软骨单位湿重的细胞含量为1.55±0.16(106个细胞/g)仅为正常人关节软骨细胞数(3.57±0.18)的41.3%。原发性OA及正常人关节软骨细胞中的CD105+细胞比率分别为95.7±1.16、95.2±1.18(%),CD166+为6.8±0.26、6.6±0.19,CD105+/CD166+为4.5±0.09、4.6±0.07,二者之间均无统计学差异(P值均>0.05);分选细胞存活率为93-95(%);经流式细胞仪检测,其分选原发性OA及正常人关节软骨MPCs的CD105+分别为96.5±1.12、95.5±1.16,CD166+为96.8±1.26、97.5±1.31,CD105+/CD166+细胞分别为93.5±1.09、94.6±1.13,而CD34+、CD45+细胞仅为0.5±0.012、0.4±0.01及0.8±0.014、0.6±0.011。与正常人关节软骨MPCs比较,原发性OA关节软骨MPCs的生长速度和增殖速率较快。2.原发性OA及正常人关节软骨MPCs成软骨诱导分化后细胞TB、Ⅱ型胶原、aggrecan染色均呈阳性,原发性OA者GAG含量减少及Ⅱ型胶原mRNA表达减弱(P<0.05);成骨诱导分化后细胞钙结节染色均呈阳性,原发性OA者ALP含量减少及BGPmRNA表达减弱(P<0.05);成脂诱导分化后细胞油红染色均呈阳性,原发性OA者TG含量增加(P<0.05)。3.10～50ng/ml的bFGF、0.1-1.0ng/ml的TGF-β1单独作用于传代培养原发性OA关节软骨MPCs时,其培养细胞的增殖速率显著增加(P<0.05),而随着二者浓度的进一步增加,其增殖速率无显著变化(P>0.05);bFGF10ng/ml+TGF-β11.0ng/ml联合作用时,对原发性OA关节软骨MPCs具有明显促增殖作用(P<0.05)。SOX6和SOX9能够分别稳定感染OA关节软骨MPCs;经二者分别感染的关节软骨MPCs成软骨诱导分化后,其TB染色、II型胶原染色呈强阳性表达,未基因感染细胞为弱阳性着色;SOX6基因感染原发性OA关节软骨MPCs的II型胶原mRNA表达量为未基因感染细胞的3.8倍(P<0.01),SOX9基因为未感染细胞的5.15倍(P<0.01)。结论:1.原发性OA关节软骨内的细胞含量显著少于正常人关节软骨。原发性OA及正常人关节软骨存在MPCs;相同数量的原发性OA及正常人关节软骨中分选出的关节软骨MPCs数量相同。原发性OA关节软骨MPCs的生长与增殖较正常人关节软骨MPCs活跃。据此推测单位体积关节软骨中,原发性OA关节软骨MPCs数量可能明显少于正常人关节软骨,并提示关节软骨MPCs在原发性OA病理过程中具有重要作用。2.关节软骨MPCs经成软骨、成骨及成脂诱导后均能分化为具有相应功能细胞特性的分化细胞;原发性OA关节软骨MPCs成软骨和成骨分化能力降低,而成脂分化能力增加,提示原发性OA关节软骨MPCs分化功能出现异常,OA关节软骨细胞对软骨损伤修复能力降低。3.bFGF、TGF-β1对原发性OA关节软骨MPCs增殖具有重要作用,不同浓度的bFGF、TGF-β1及bFGF+TGF-β1促增殖作用不同。构建的SOX6、SOX9基因序列与基因库报道序列完全一致;SOX6和SOX9能稳定感染原发性OA关节软骨MPCs,并显著促进感染细胞成软骨分化。提示通过适宜浓度的bFGF、TGF-β1对原发性OA关节软骨MPCs的作用及SOX6和SOX9基因感染,可能具有促进原发性OA关节软骨损伤修复的作用。