霉菌作为丝状真菌,遍布自然界。人们常常“谈霉色变”,主要是由于其巨大的危害性。霉菌可以造成食品和生活用品霉变,植物和动物的病害,甚至能产生化学类致癌毒素。霉菌也有有益的一面,在传统食品工业上应用广泛。为了更好地利用霉菌,同时避免霉菌的危害,了解霉菌生理过程至关重要。目前对于霉菌生理过程的研究方法主要有分子生物学方法（包括基因工程和基因组分析）、生化研究方法（提取菌丝细胞内物质分析）以及显微技术等。但这些方法都存在一定缺陷,比如实验周期过长,不能实时监测,对霉菌有伤害从而不能反映其正常生理状态等。而且,绝大多数的方法都是对霉菌菌丝群体进行监测。由于单根菌丝细胞从其基因到其行为均具有高度异质性,群体监测法分析出的结果往往缺乏精准性和代表性。对单个微生物细胞分析能更完全地描述霉菌的环境分布和活性,是揭示其不可见化学过程的重要手段,对于我们理解细胞生化过程和行为与群体水平现象的细胞基础之间的关系必不可少。因此,从生物学角度考虑,实时在线地分析完整的单根菌丝更能真实反映霉菌生理状态。生物活性小分子如活性氧（ROS）和钙离子(Ca²⁺)在霉菌发育代谢过程中起着重要作用。由于缺乏较为直接的研究手段,内源性小分子在菌丝细胞生命发育过程中的动力学机制尚不明确。单菌丝分析方法可用于真菌的生化机制研究,更好地揭示真菌发育过程,并为真菌防控提供理论支持。由于霉菌特殊的形态和细胞结构,目前已有的很多单细胞分析技术并不适用于霉菌菌丝分析。本研究针对以上问题,以活的、单根霉菌菌丝为实验对象,针对霉菌细胞的特点构建了霉菌单菌丝分析平台,并进一步利用该平台研究了生物活性小分子参与黄曲霉菌发育的生物学机制。主要工作如下:1.电致发光单菌丝分析平台在过氧化氢释放监测中的应用本研究首次将电致发光技术（ECL）运用于霉菌细胞检测,开发了基于鲁米诺电化学发光系统的单菌丝过氧化氢（H₂O₂）释放分析平台。基于H₂O₂可增敏ECL发光强度的原理,该平台可检测浓度范围为20-600 nM的H₂O₂,其检测下限为20 nM。通过将黄曲霉菌丝GZ-6贴壁生长在导电玻璃表面,可成功实时监测到由丙二醇甲醚醋酸酯（PMA）和柠檬醛（CIT）刺激诱导单根菌丝细胞释放的H₂O₂。该单菌丝分析平台进一步加深了我们对微生物异质性的理解,并为霉菌生理生化研究提供了一种重要的手段。2.纳米光纤单菌丝分析平台在胞内活性氧检测中的应用电致发光单菌丝平台只能对整个菌丝释放H₂O₂进行检测,并不能实现对胞内活性氧,尤其是胞内某具体部位活性氧分布进行检测。针对这一局限性,我们开发了基于纳米光纤的单菌丝分析平台。该平台具有纳米级时空分辨率的光纤尖端,可通过电动微操作系统进行四维控制改变其方向和位置,满足对于同一菌丝细胞不同部位的实时检测。本研究采用纳米光纤传感器对平均直径小至5μm的黄曲霉单菌丝细胞内ROS进行分析,发现ROS在单根菌丝内呈不均匀分布。以菌丝横隔为界,ROS在菌丝最前端一节的浓度最高,且在越远离尖端的节段内浓度越低;ROS菌丝最前端一节内也存在梯度分布,越靠近尖端浓度越高。通过对菌丝细胞进行透射电子显微镜（TEM）制样检测,我们推测菌丝细胞内不同部位ROS的分布差异可能与细胞内的线粒体量和结构有关,且ROS在尖端的分布可能与菌丝生长有关。3.单菌丝胞内活性氧（ROS）和钙离子(Ca²⁺)分布与菌丝顶端优势的关联进一步在纳米光纤单菌丝分析平台的基础上,对单根黄曲霉菌丝胞内ROS和Ca²⁺分布情况及其与菌丝顶端优势的关联进行了探索。本研究中,在菌丝萌发阶段胞内横隔尚未形成,我们将菌丝细胞按距离菌丝顶端远近人为划分为三部分,在萌发不同时间段对三部分ROS和Ca²⁺分别进行检测。结果显示,菌丝胞内ROS和Ca²⁺的梯度分布并不是一开始就存在,而是随着发育时间的延长而逐步建立,与顶端生长均有一定联系。在实验体系中分别引入了ROS清除剂和Ca²⁺螯合剂以及两种药物的混合液,再对菌丝细胞生长情况进行检测。结果显示,加入拮抗剂的菌丝与正常生长时相比,菌丝顶端优势均有不同程度的抑制。基于以上实验结果,我们提出ROS和Ca²⁺在菌丝细胞顶端优势过程中可能存在协同调控机制的假说。综上所述,本研究以活体单菌丝为研究主体,针对霉菌细胞特殊的形态和结构建立了单菌丝检测平台,并利用该平台研究了黄曲霉菌发育过程中ROS在真菌菌丝胞内分布的差异,以及菌丝顶端优势时内源性ROS和Ca²⁺之间的调控关系,初步揭示了生物活性小分子在霉菌细胞发育过程中的可能作用。本研究可望为霉菌的基础研究提供一种分析方法以及研究思路。