【摘 要】
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目的:探索口服五步蛇毒后能否以蛋白或多肽形式经消化道吸收入血及五步蛇毒蛋白在消化道的主要吸收部位;通过腹腔注射环磷酰胺建立免疫抑制小鼠模型,检测口服五步蛇毒对正常小鼠和免疫抑制小鼠免疫功能的影响;探究五步蛇毒增强免疫抑制小鼠免疫功能作用的机制。为五步蛇毒的药物开发和临床应用提供实验依据和理论基础。方法:（1）采用给大鼠灌胃的方式口服五步蛇毒,利用Shotgun质谱技术检测五步蛇毒蛋白通过消化道后进
【基金项目】
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项目名称:眼镜蛇毒NGF通过信号通路诱导肝星状细胞凋亡的研究,项目合同编号:81360078,项目来源:国家自然科学基金,项目起止时间:2014.1-2017.12；
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目的:探索口服五步蛇毒后能否以蛋白或多肽形式经消化道吸收入血及五步蛇毒蛋白在消化道的主要吸收部位;通过腹腔注射环磷酰胺建立免疫抑制小鼠模型,检测口服五步蛇毒对正常小鼠和免疫抑制小鼠免疫功能的影响;探究五步蛇毒增强免疫抑制小鼠免疫功能作用的机制。为五步蛇毒的药物开发和临床应用提供实验依据和理论基础。方法:（1）采用给大鼠灌胃的方式口服五步蛇毒,利用Shotgun质谱技术检测五步蛇毒蛋白通过消化道后进入大鼠血液的情况;利用免疫组化检测五步蛇毒蛋白在大鼠胃肠道组织内的分布;利用HE染色检测口服五步蛇毒对大鼠胃肠道组织形态结构的影响。（2）通过腹腔注射环磷酰胺建造免疫抑制小鼠模型,正常小鼠和免疫抑制小鼠分为五步蛇毒低、中、高剂量组,每日分别灌胃给与30、60、120 mg/kg的五步蛇毒,连续给药14天,观察小鼠的呼吸、精神状态等生命体征。处死小鼠取脾脏和胸腺组织称重后,计算小鼠脾脏、胸腺指数;制备脾细胞悬液,利用CCK-8法检测Con A诱导的小鼠T淋巴细胞增殖反应和LPS诱导的B淋巴细胞增殖反应;碳粒廓清法检测小鼠吞噬系数α;中性红法检测小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬率;利用二硝基氟苯诱导小鼠迟发型超敏反应,检测小鼠耳廓肿胀度。探究口服五步蛇毒对正常小鼠和免疫抑制小鼠免疫功能的影响。（3）通过腹腔注射环磷酰胺建立免疫抑制小鼠模型,连续灌胃给与30、60、120 mg/kg的五步蛇毒14天,以西洋参作为阳性对照组。利用HE染色对小鼠进行脾脏组织病理学检查;利用流式细胞技术检测小鼠外周血CD4+、CD8+T细胞亚群的变化;利用ELISA法检测小鼠脾脏组织中TNF-α、IL-4细胞因子水平;利用实时荧光定量PCR法检测小鼠脾脏组织中转录因子T-bet、GATA-3mRNA的表达水平;利用Western bolt法检测小鼠脾脏组织中c GAS-STING信号通路相关蛋白STING、IRF3的表达水平,探索口服五步蛇毒增强免疫抑制小鼠免疫功能作用的机理。结果:（1）口服五步蛇毒1 h、3 h后的大鼠血浆中分别检测出各有4组和3组蛋白质与五步蛇毒蛋白质数据库匹配,主要活性蛋白为蛇毒金属蛋白酶和酸性磷脂酶A2;五步蛇毒进入消化道后,免疫组化显示在大鼠胃、十二指肠组织均有分布,口服1 h时主要分布在胃和十二指肠组织内,口服3 h时主要分布在十二指肠组织内。（2）不同剂量的五步蛇毒均能明显提高正常小鼠脾脏指数（P＜0.05）,改善环磷酰胺所致的胸腺和脾脏萎缩、增强免疫抑制小鼠的B淋巴细胞增殖活性和腹腔巨噬细胞吞噬率（P＜0.05）;中剂量（60 mg/kg）的五步蛇毒能促进正常小鼠的T、B淋巴细胞增殖、明显提高正常小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬系数和吞噬率、促进正常小鼠的迟发型超敏反应（P＜0.05）,增强免疫抑制小鼠的T淋巴细胞增殖活性降低（P＜0.05）;高剂量（120 mg/kg）的五步蛇毒能促进正常小鼠的T、B淋巴细胞增殖、提高正常小鼠单核巨噬细胞的吞噬系数和吞噬率、促进正常小鼠的迟发型超敏反应（P＜0.05）,升高免疫抑制小鼠的单核巨噬细胞吞噬系数、恢复免疫抑制小鼠的迟发型超敏反应（P＜0.05）。（3）低、中剂量（30、60 mg/kg）的五步蛇毒能明显提高免疫抑制小鼠T-bet mRNA的表达水平和T-bet/GATA-3比值、降低GATA-3 mRNA的表达水平（P＜0.05）;低、中剂量（30、60 mg/kg）的五步蛇毒能明显提高免疫抑制小鼠外周血CD4+T淋巴细胞百分比、降低CD8+T淋巴细胞百分比（P＜0.05）;中剂量（60 mg/kg）的五步蛇毒能明显下调免疫抑制小鼠STING、IRF3蛋白的表达水平（P＜0.05）;高剂量（120 mg/kg）的五步蛇毒能提高免疫抑制小鼠脾脏细胞因子TNF-α、IL-4的浓度（P＜0.05）。结论:口服五步蛇毒部分活性蛋白质可以以蛋白或多肽的形式经消化道吸收,主要吸收部位在十二指肠和胃。五步蛇毒经消化道吸收后对正常小鼠和免疫抑制小鼠的免疫功能有不同程度的提高,能明显增强小鼠的体液免疫、细胞免疫和非特异性免疫功能,改善环磷酰胺导致的小鼠免疫抑制状态。口服五步蛇毒可能通过提高免疫抑制小鼠脾脏细胞因子TNF-α和IL-4的水平,调节转录因子T-bet、GATA-3 mRNA的表达水平,调控cGAS-STING信号通路达到免疫调节作用。本研究结果表明五步蛇毒口服毒性低,对免疫功能有明显提高作用,具有较好的药物开发价值和应用前景。
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