持续性有机污染物DDT虽已被禁止或限用多年,但由于其具有生物累积性、持久性、脂溶性、难降解和食物链富集性等特点,在环境和人体仍有很高的检出率。此外,一些发展中国家仍用DDT来控制疟疾,使得这些国家成为DDT高暴露区。肝脏是DDT进行代谢、解毒和积累的主要场所和器官。有报道揭示,DDT可以引起肝脏肿大、损伤以及肿瘤等疾病。然而目前关于DDT残留和肝脏健康风险的研究主要集中在流行病学和实验动物毒性评价方面,具体的分子机制还不是很清楚,且关于DDT暴露引起的肝脏毒性干预研究尚未见报道。本研究采用低剂量(人体血液DDT检出量)和高剂量(高暴露区环境DDT含量)DDT主要成分p,p’-DDT暴露人肝癌细胞或人正常肝脏细胞,围绕氧化应激靶点以及可能的调控信号通路,分析p,p’-DDT暴露导致肝癌恶化以及肝脏损伤的分子毒理机制。本研究内容含以下四个部分：第一部分：低剂量p,p’-DDT暴露对人肝细胞癌生长的影响及其机制研究。采用MTT方法分析低剂量p,p’-DDT暴露对人肝癌细胞HepG2增殖的影响。结果显示低浓度p,p’-DDT暴露HepG2细胞四天后促进了细胞增殖,细胞中ROS含量升高,抗氧化酶y-GCS和SOD活性降低。蛋白印迹法检测p,p’-DDT对Wnt/β-catenin信号通路的影响,发现GSK3pβ、β-catenin及其下游与增殖密切相关的靶蛋白c-Myc和CyclinD1表达均升高。加入ROS抑制剂NAC后,这些蛋白表达被逆转。此外,p,p’-DDT促进的HepG2细胞增殖可被NAC或β-catenin siRNA处理所降低。利用肝癌裸鼠成瘤模型,采用免疫组化和蛋白印迹法检测5 nM/Kg p,p’-DDT暴露对裸鼠肝细胞癌肿瘤组织氧化应激水平和Wnt/β-catenin通路的影响。发现p,p’-DDT增加了裸鼠瘤的生长,激活了肝癌肿瘤组织氧化应激和Wnt/β-catenin信号通路。研究表明,当低剂量p,p’-DDT暴露于肝癌细胞后,首先激活细胞中ROS生成和氧化应激反应；进而促进GSK3β在丝氨酸第九位点的磷酸化；激活的β-catenin进入细胞核与核转录因子TCF相结合,促进下游与增殖相关的靶蛋白(c-Myc和CyclinD1)表达,从而促进人肝癌细胞的增殖和肝细胞癌的生长。第二部分：低剂量p,p’-DDT暴露对人肝细胞癌粘附的影响及其机制研究。采用细胞粘附方法检测低剂量p,p’-DDT对肝癌细胞粘附的影响。结果表明：p,p’-DDT暴露HepG2细胞六天后,降低了细胞与细胞之间的粘附,提高了细胞与基质之间的粘附。p,p’-DDT增加了HepG2细胞中ROS含量,激活了JAK/STAT3信号通路。此外,加入ROS抑制剂NAC后,这种效应被显著逆转。而加入雌激素受体拮抗剂ICI抑制雌激素受体ER后,对p,p’-DDT诱导的现象没有影响。表明p,p’-DDT可能通过ROS而非ER介导其调控的细胞粘附。p,p’-DDT还影响HepG2细胞粘附分子的表达,它的暴露导致E-cadherin降低,N-cadherin和CD29升高。进一步研究揭示,p,p’-DDT影响的粘附分子表达能够被JAK抑制剂或STAT3抑制剂所逆转。同样地,p,p’-DDT激活了肝癌裸鼠肿瘤组织中JAK/STAT3信号通路,影响了E-cadherin、N-cadherin和CD29的基因表达。研究表明,p,p’-DDT通过提高细胞中ROS含量,介导JAK/STAT3信号通路激活,调控下游粘附分子表达；降低细胞与细胞间的粘附,增强细胞与基质间的粘附,促进肝癌细胞的恶化。第三部分：高剂量p,p’-DDT暴露对人正常肝脏细胞的毒性及维生素C和E的拮抗效果研究。采用流式细胞技术检测p,p’-DDT对人正常肝脏细胞HL-7702存活的影响,发现大于10 μM的p,p’-DDT暴露HL-7702细胞后,显著诱导细胞凋亡。进一步检测线粒体膜电位以及caspases家族蛋白的表达,结果显示p,p’-DDT暴露HL-7702细胞后,显著提高了细胞中ROS含量和促凋亡基因Bax的表达,降低了抗凋亡基因Bcl-2的表达,从而提高线粒体膜的去极化致使膜受到损伤。细胞色素c从线粒体释放到细胞质中,诱导caspase-9和3的活性形式产生,激活线粒体凋亡信号通路。与此同时,p,p’-DDT通过ROS介导下游NF-κB的激活,活化的NF-κB进入细胞核促进下游FasL的表达,随后结合到其死亡受体Fas上,激活死亡受体介导的凋亡信号通路,促进HL-7702细胞凋亡。然而,加入天然抗氧化物维生素C和E后,抑制了p,p’-DDT诱导的ROS生成及下游凋亡信号通路的激活,由此降低p,p’-DDT的细胞毒性,缓解细胞凋亡,且维生素C和E复合加入的效果大于单独加入的效果。本研究表明,维生素C和／或E可以拮抗p,p’-DDT引起的HL-7702细胞毒性。第四部分：高剂量p,p’-DDT暴露对人正常肝脏细胞的基因毒性和肝脏毒性及维生素C和E的拮抗效果研究。采用了DAPI染色、彗星实验、微核试验、DNA和蛋白质交联实验等方法,多方面评价了p,p’-DDT对人正常肝脏细胞HL-7702的基因毒性。结果显示：p,p’-DDT暴露后,剂量依赖性地提高了细胞中染色质浓缩、彗星实验参数、微核诱导率以及DPC系数。表明p,p’-DDT暴露可以诱导HL-7702细胞产生基因毒性,引起DNA损伤和染色质浓缩。采用qRT-PCR检测p,p’-DDT暴露对HL-7702肝细胞毒性的影响,发现P,P’-DDT暴露对HL-7702细胞具有明显肝脏毒性,具体表现在Ⅰ相代谢酶基因(CYP1A1、CYP2B6和CYP3A4)表达升高,Ⅱ相代谢酶基因(UGT、GST和GCS)表达下调。本研究还揭示维生素C和E可以拮抗p,p’-DDT引起的HL-7702细胞DNA损伤和代谢酶变化,即基因毒性和肝脏毒性,且二者复合的拮抗效果大于单独加入的效果。综上所述,本研究评价了p,p’-DDT暴露对肝脏的毒性作用,包括低剂量p,p’-DDT暴露对肝癌细胞恶化的影响以及高剂量p,p’-DDT暴露对正常肝脏细胞的损伤；围绕氧化应激靶点及可能的调控信号通路,阐明了p,p’-DDT暴露引起肝脏健康风险的相关分子机制；分析了天然抗氧化物维生素C和E对p,p’-DDT毒性的拮抗作用。因此,本研究有助于阐明持续性有机农药DDT残留引起的人体肝脏健康风险及分子机制,为干预DDT暴露引起的肝脏毒性提供了一定的防控依据。