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前言 围手术期常由于手术、麻醉及病情进展出现严重机体低氧。由于脑细胞对缺氧的高度敏感和对线粒体有氧代谢的高度依赖,极易出现急性缺氧性脑损伤,而缺氧后复氧形成的次发性损伤,则更为严重。预吸氧是目前临床麻醉中预防缺氧的主要措施,但高氧吸入并不能完全避免脑缺氧发生,因而会出现预吸氧-缺氧-复氧的临床过程。一般认为麻醉中高氧吸入不会造成机体严重损害,但高氧是引起机体氧化应激的重要因素,因此,预吸氧可能对脑细胞产生不利影响。然而由于预吸氧对缺氧复氧性脑损伤的影响还缺乏系统的研究,因此其临床应用的合理性和有效性尚有待于验证。本研究采用大白鼠脑缺氧-复氧模型,通过免疫组织化学等技术,观察两种预吸氧浓度条件下,脑皮质HSP70表达,神经元损伤程度,以及脑线粒体Mn-SOD活力的变化,以探讨预吸氧对脑损伤的影响及其机制,为预吸氧在麻醉学和急救医学等相关领域的合理应用提供理论依据。 实验材料及方法 1.实验分组及试验: 成年纯种、雄性Wistar大白鼠84只,体重230-280克,随机平均分为:对照组(A组)、50%预吸氧试验组(B组)、100%预吸氧实验组(C组)三组,每组再按照预吸氧(或常氧)-缺氧-复氧1h-复氧6h四阶段分为四个亚组(共计12亚组,每亚组7只)。A1、B1、C1组大鼠,分别吸入空气、50%和100%浓度氧气30min;AZ人人 组经上述 1亚组预吸氧处理后,吸人含 5%浓度氧的低氧气体缺氧 30min;A3-4在3-4J3-4组大鼠经上述预吸氧一缺氧实验后,吸人100%浓度氧气复氧N或6h;AI组吸入室内空气(常氧L作为正常对照,AZ组作为缺氧对照,A3、A4组作为缺氧一复氧对照。各组于实验结束后,用10%水合氯醛p50mg/kg)腹腔麻醉,开颅取大脑,保存待检。 2.标本采集和处理: 2.l 生化检测标本,于开颅取脑后立即置于Eppendorf管中,-70℃冰箱保存。 2.2 免疫组化标本,10%甲醛中固定24h,常规脱水,石蜡包埋。 3.标本检测方法: 3.l 免疫组织化学方法:石蜡包埋切片后,按照SABC试剂盒步骤操作,细胞内出现棕黄色颗粒者为阳性细胞。免疫组化结果在400倍光镜下观察,计算大脑皮质高倍镜视野中阳性细胞个数八 00个细胞,每张切片计数 5个视野,求出阳性率。 3.2 黄源吟氧化酶法:制备脑组织匀浆,蛋白定量,按照超氧化物歧化酶瞩OD)测定试剂盒说明书进行操作。 3.3 硫代巴比妥酸法:制备脑组织匀浆液,进行蛋白定量,按照MDA测定试剂盒说明操作。 3.4 脑病理组织学观察:脑组织切片 HE染色,在 100倍或400 $光镜下观察脑组织病理学变化。 4.数据处理和统计分析: 所有数据以X比表示,编辑SS数据文件,应用S进行单因素方差分析或t检验,各组与对照组比较用 Dunnet t检验J<0.05为差异显著。 ·2· 结 果 l.对照组 HSpoo、MDA和 Mn-SOD实验结果 在A组中,与AI组相比,A4组HSP70阳性神经元显著增加,A3组 HSpoo阳性细胞消失,A4组 HSP70与前三组对比均显著增加瞩<o.05人与以组相比,A二一A4组**A含量均升高,但只有 AZ组差异显著河<0.05厂 A3、A4组与 AZ组对比 MDA显著减低瞩<0.05人 Mll-SOD活力在 AZ-A4组逐渐升高,A3、A4组与M组对比及A4组与AZ组对比差异显著河<0.05人结果见表1。 2.预吸氧组HSP70、MDA和Mn—SOD实验结果 与A组对应亚组相比,B组J组各亚组(除 CZ亚组外)HSP70阳性细胞率显著增加(P<0.05入 Mll-SOD活力多有升高趋势,但仅 B3组差异显著;MDA含量 BZ人 组显著低于 AZ组瞩<O.05入其余各亚组组间差异不显著。结果见表L 3.脑组织病理学观察结果 正常神经元形态正常,呈现典型的多极性,缺氧后神经元水肿、变性,复氧后损伤进一步加重。50%预吸氧组神经元出现轻度损伤,100%预吸氧组神经元损伤加重。预吸氧后缺氧损伤程度没有减轻,100%预吸氧缺氧组损伤更加严重。50%预吸氧缺氧复氧神经元损伤与缺氧复氧对照组无明显差别,而100%预吸氧后缺氧复氧组病理改变加重。 讨 论 缺氧复氧性脑损伤是临床常见且预后不良的一种病理生理改变。脑缺血/再灌注或缺就复氧的特征性变化是线粒体的过氧化 ·3·KAMHO)反应增强,而能够引起线粒体过氧化的主要原因是活性氧。线粒体过氧化与神经元的损伤程度和预后密切相关。Mn-SOD定位于线粒体,是线粒体抗氧化损伤的重要内源性酶,它通过特异性歧化反应清除体内超氧阴离子,保护细胞免受活性氧的损伤。活性氧对Mn-SOD具有诱导作用,而且与氧化应激的程度相关,因此,Mn-SOD反映线粒体过氧化和神经元损伤的严重程度。热休克蛋白(Heat shock Proteins,HSPs)是生物体在不良刺激下生成的一组重要蛋白质,对神经元急性损伤很敏感,在神经元损伤的早期就已经开