蜜蜂在农业生产和生态系统维护方面起着举足重轻的作用。然而,由蜜蜂微孢子虫寄生引起的蜜蜂微粒子病致使蜂群采集力下降甚至毁灭整个蜂群,因此,建立简单快速鉴别蜜蜂微孢子虫的方法,对蜜蜂产业具有重大意义。环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是基于靶基因的6个区域设计4种特异的引物,利用一种链置换DNA聚合酶在恒温条件反应1h即可完成核酸扩增。为了提高蜜蜂微粒子病检测的灵敏度和适用性,利用环介导等温扩增技术,以从重庆酉阳分离的东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)为研究对象,针对其16S rDNA的6个不同片段设计4种特异性引物,采用链置换活性的Bst DNA聚合酶在60℃恒温条件下反应60min以检测东方蜜蜂微孢子虫。本研究对LAMP技术在蜜蜂微孢子虫的检测进行了探索,建立了快速简便地检测东方蜜蜂微孢子虫的LAMP体系,与常规PCR相比,具有高灵敏度、高特异性,并在无特殊仪器设备的条件下即可完成检测任务,为广大养蜂场及时发现东方蜜蜂微孢子虫提供了有力的检测工具,为东方蜜蜂微孢子虫的防控提供依据。具体研究结果如下:1.东方蜜蜂微孢子虫的LAMP引物设计及其反应条件的优化本研究以从重庆酉阳分离到的东方蜜蜂微孢子虫(N.ceranae)为研究对象,对N.ceranae的16S rDNA基因、ptp2基因swp12基因序列进行引物设计以及最佳引物的筛选。对三组引物进行实验验证后,选定16S rDNA基因作为检测靶标。然后东方蜜蜂微孢子虫的基因组DNA作为模板,成功构建了重组质粒pMD19-T-Nc16S rDNA,并将其作为LAMP检测的阳性对照。为了确立最佳反应条件,我们以重组质粒pMD19-T-Nc16S rDNA为模板,对LAMP反应的温度、时间、反应体系中一对内引物FIP/BIP的浓度及Bst DNA聚合酶的用量进行优化。结果表明,LAMP反应的最佳条件是内引物FIP/BIP的浓度为5μmol/L,聚合酶的用量为800 U,在60℃反应一小时。2.LAMP技术在东方蜜蜂微孢子虫检测中的特异性和灵敏度为了检测我们设计的LAMP实验是否能特异的检测东方蜜蜂微孢子虫,我们以蜜蜂常见的病原体球囊菌以及中蜂囊状幼虫病毒作为东方蜜蜂微孢子虫的对照,进行LAMP检测。实验结果显示,只有东方蜜蜂微孢子虫基因组DNA为模板时能够扩增出梯形条带,而其他模板均未扩增出条带,这一结果说明本检测体系具有较高的特异性,可以特异检测东方蜜蜂微孢子虫。为了测定LAMP检测东方蜜蜂微孢子虫的灵敏度,以重组质粒和东方蜜蜂微孢子虫基因组DNA作为模板分别进行LAMP和常规PCR检测,实验结果显示,对于重组质粒pMD19-T-Nc 16S rDNA,LAMP能检测到的最低浓度为1.735×10-2ng/μL,PCR能检测到的最低浓度为1.735×10-1ng/μL。对于东方蜜蜂微孢子虫基因组DNA,LAMP能检测到的最低浓度为1.475×10-3ng/uL,PCR能检测到的最低浓度为1.475×10-1ng/uL,表明LAMP比PCR有更高的检测灵敏度。3.LAMP技术对感染东方蜜蜂微孢子虫的蜜蜂中肠的检测我们取未感染的正常中肠以及感染不同浓度的N.ceranae的中肠,研磨后进行显微镜检,并提取其基因组DNA,并用LAMP法和常规PCR法对其基因组进行检测。结果显示,通过显微镜检并对十个视野下观察到的微孢子虫数量统计发现,感染N.ceranae的浓度为105个/mL时,十个视野下可观察到11个孢子,感染N.ceranae的浓度为104个/mL和103个/mL时,十个视野下都没有观察到孢子。LAMP法最低能够检测到的孢子浓度为1.2×104个/mL,而常规PCR法只有阳性质粒得到了扩增条带。因此对于感染了N.ceranae的中肠组织的检测,LAMP方法的检测灵敏度远高于常规PCR方法的灵敏度。综上,本文对LAMP技术在东方蜜蜂微孢子虫的应用进行了研究,结果显示,东方蜜蜂微孢子虫的16S rDNA基因可作为LAMP法检测东方蜜蜂微孢子虫的靶标,为后续应用LAMP技术检测养蜂场的病蜂奠定基础。