目的：化疗药物和靶向药物作用机制不同，联合应用可能产生增效作用，故联合用药是研究热点。但目前国内、外尚无多靶点酪氨酸激酶（RTK）抑制剂（索拉非尼）和化疗药物（培美曲塞）联合用药疗效的研究。因此我们探讨索拉非尼和培美曲塞联合治疗对EGFR-TKIs耐药的非小细胞肺癌细胞株的细胞毒作用、最佳的联合用药方式以及协同和拮抗作用的机制。方法：在A549（EGFR野生型和KRAS突变）和H1975（EGFR突变和KRAS野生型）EGFR-TKIs耐药的细胞株中进行研究。观察培美曲塞和/或索拉非尼联合应用的IC50值，CI（联合指数）以及对细胞周期分布、MAPK信号通路的影响。结果：在A549和H1975两个EGFR-TKIs耐药的非小细胞肺癌细胞株中联合应用索拉非尼和培美曲塞的细胞毒性作用呈剂量依赖性。培美曲塞序贯索拉非尼可产生协同效应，优于索拉非尼序贯培美曲塞以及两药同时应用。索拉非尼和培美曲塞联合应用的细胞毒性作用呈程序依赖性。细胞周期分析显示索拉非尼阻抑细胞在G1期，而培美曲塞阻抑细胞在S期。先用索拉非尼诱导细胞阻滞在G1期，阻碍了随后特异性作用于S期的细胞毒性药物（培美曲塞），从而产生拮抗作用。细胞信号通路分析显示培美曲塞导致p44/42MAPK水平的增加可被继之应用的索拉非尼所抑制。MAPK激酶抑制剂U0126同样呈程序依赖性地增强培美曲塞的细胞毒作用。序贯应用U0126同样可抑制培美曲塞激活MAPK信号通路。结论：在EGFR-TKIs耐药的非小细胞肺癌细胞株中，培美曲塞序贯索拉非尼能产生协同效应且优于其它联合用药方式。其协同机制是由于索拉非尼抑制培美曲塞激活MAPK信号通路。本研究结果为EGFR-TKIs耐药的非小细胞肺癌患者的临床治疗策略提供了分子生物学证据。