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研究目标:1 SENP5生物学信息;2 SENP5在肝癌细胞、组织中的表达情况;3 SENP5对肝癌细胞生长的影响;4 SENP5对肝癌细胞DNA损伤的影响;5 SENP5调控DNA损伤应答的机制。材料和方法:1通过相关数据库查阅生物信息学对SENP5进行多方面分析,获得研究线索。2实时定量PCR检测肝癌组织样本及相应的邻近正常组织样本中SENP5的mRNA相对表达水平,免疫印迹分析肝癌组织样本及相应的邻近正常组织样本中SENP5的蛋白表达水平,免疫组化检测肝癌及癌旁组织的SENP5表达,免疫印迹检测正常肝细胞及肝癌细胞中SENP5蛋白的表达水平,免疫荧光(IF)检测Hep3B细胞中SENP5的亚细胞定位。3 HepG2细胞转染非靶向SENP5基因的siRNA(NC)或靶向SENP5基因的siRNA,转染48小时后收获细胞通过荧光实时定量PCR检测HepG2细胞SENP5基因的mRNA相对表达水平,Western blot检测HepG2细胞中SENP5蛋白表达水平。BrdU实验测定HepG2细胞转染非靶向SENP5基因的siRNA(NC)或靶向SENP5基因的siRNA后细胞增殖能力,克隆形成实验测定HepG2细胞克隆形成能力。将转染非靶向SENP5基因siRNA(NC)或靶向SENP5基因siRNA的HepG2细胞注射到裸鼠的前肢皮下,在肿瘤细胞注射后第40天测定肿瘤重量。4对转染非靶向SENP5基因siRNA(NC)或靶向SENP5基因siRNA的HepG2细胞进行不同放射剂量的照射,照射后进行细胞存活实验(CCK8法)。对转染非靶向SENP5基因siRNA(NC)或靶向SENP5基因siRNA的HepG2细胞进行持续24小时10μMM依托泊苷处理并设置对照组,流式细胞术检测细胞凋亡率。免疫印迹法对依托泊苷处理组和对照组细胞检测,测定细胞周期阻滞和DNA损伤修复相关的检验点激酶蛋白CHK1、p-CHKl、H2AX、p-H2AX的变化情况。5通过RNA干扰技术和免疫共沉淀实验检测SENP5蛋白对DNA损伤相关蛋白ATRIP的类泛素化修饰作用。结果:1多个数据库显示SENP5在多个肿瘤组织中高表达包括肝癌组织,SENP5是SUMO的特异性蛋白酶;2无论在mRNA水平还是在蛋白水平SENP5在肝癌细胞、组织中存在过表达,而且亚细胞定位于细胞核中;3 BrdU实验和克隆实验证实敲减了 SENP5的HepG2细胞增殖明显受到抑制,接种裸鼠的体内实验也证实敲减了SENP5后肿瘤重量减轻;4转染靶向SENP5基因siRNA的HepG2细胞明显比转染非靶向SENP5基因siRNA(NC)的细胞对化疗药物和放射线敏感性增加,这和DNA损伤的细胞周期阻滞有关,包括ATR活性降低以及ATR底物(CHK1、H2AX)磷酸化水平降低;5在分子水平,我们发现SENP5能够通过促进ATRIP的去类泛素化修饰调控DNA损伤应答。结论:我们的实验数据显示肝细胞癌的生长和DNA损伤应答需要SENP5且SENP5或许能成为一个有前途的肝细胞癌药物靶点。