黑龙江野鲤细菌人工染色体基因组文库的构建及在基因组研究中的应用

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鲤鱼作为基因组最大的鱼类,在进化上具有重要的研究价值。目前国内外尚未开展对鲤鱼整个基因组的研究。本研究构建了鲤鱼的BAC文库,并建立了2步3维PCR、荧光原位杂交技术和染色体显微切割技术等BAC文库筛选和基因组分析方法。为开展鲤鱼基因组、功能基因组及蛋白质组研究建立了基础。本研究通过采集黑龙江野鲤全血细胞制备琼脂糖凝胶包埋块的方法获得了高分子量(HMW)DNA。为产生大小比较集中的片段,进行了BamHⅠ酶切反应最佳酶浓度梯度预试验,选择出最佳酶切反应条件,并进行两次片段选择。利用BamHⅠ酶切和PFGE电泳分离选择获得100-300kb的DNA片段,用电洗脱的方法将DNA片段从琼脂糖凝胶上洗脱下来并且使用PEG8000透析对产物进行了浓缩和纯化。克隆载体为pEZ BAC,大小为7.2kb。首次构建了黑龙江野鲤的BAC文库,该库含有46,656个克隆,插入片段大小在50-300kb之间,平均大小在100kb左右,覆盖鲤鱼全基因组2.45倍。获得的BAC克隆,保存在378块96孔板和27块384孔板中。使用8对引物(8种基因)对黑龙江野鲤BAC基因组文库进行筛选。构建了27个超级池,采用2步3维PCR方法,直接进行菌液PCR和转化成菌落PCR,实验证明将菌液转化成菌落后进行PCR初步筛选是可行的,并且证明所构建的专用于调取基因的BAC文库能够用于筛选基因。同时建立了高效稳定的2步3维PCR筛选黑龙江野鲤BAC文库的方法。本实验还对荧光原位杂交的过程进行了摸索和完善,同时对染色体的端粒进行染色体显微切割,通过二次PCR扩增,获得了清晰的条带。构建了鲤鱼的血细胞培养制备染色体方法、鲤鱼的荧光原位杂交技术和染色体显微切割技术,为今后进一步进行鲤鱼的功能基因定位及染色体步行、BAC-FISH等研究工作打下重要的基础。
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