研究背景和目的：肺癌近年来已跃居成为中国乃至全世界发病率及死亡率最高的恶性肿瘤,尤其是在男性肿瘤患者中所占的比例正逐年增加。肺癌的治疗效果一直不理想,主要的原因在于多数肺癌患者在就诊时已出现了转移,一般状况差,治疗手段少,而即使是能够手术的早,中期患者,术后仍有部分患者需要面临复发和(或)转移的问题。化疗药物的出现,曾经使肺癌患者找到生存的希望,但是越来越多全球性的大样本的综合数据分析发现,在没有经过筛选的肺癌患者中,化疗药物对于患者的5年生存率提高不超过10%。靶向药物治疗是近年来非常热门的治疗模式,自2003年吉非替尼(针对EGFR的酪氨酸激酶抑制剂)上市以来,越来越多的靶向治疗药物应用到临床,包括针对VEGF的贝伐珠单抗,针对ALK和ROS-1的克唑替尼等等,肺癌的治疗开启了个体化治疗的新模式。靶向药物的使用,使肺癌患者的PFS(无疾病进展时间)得到了明显的改善,提高患者的生活质量,而OS(总体生存时间)的数据仍然需要更多的大宗临床报道进行验证和补充。靶向治疗使与肺癌相关的信号通路研究越来越受到重视,而新的信号通路的发现也为靶向药物的研制提供理论基础。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPK)信号转导通路是近年来信号转导方面最活跃的研究领域之一。研究表明,MAPK信号转导通路通过影响细胞内基因的转录和调控,在细胞增殖、分化、凋亡、血管发生及肿瘤转移中发挥着重要作用,这些研究的进展有可能为肿瘤的治疗提供新的靶点。从某种意义上说,肿瘤的发生反映了肿瘤细胞增殖和死亡之间平衡的失调,肿瘤细胞常表现为抵抗凋亡和促进增殖。生长因子受体介导的MAPK信号转导途径是诸多信号途径中与细胞增殖、分化密切相关的重要信号途径之一。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是细胞外各种信号从细胞表面转导到细胞核内部的重要传递者。在哺乳动物中,MAPK家族的14个成员被分成了8个亚家族。包括经典的p38 MAPK、细胞外信号调节蛋白激酶(ERK1/2)、c-jun N末端激酶(JNK1/2/3)、大丝裂原活化蛋白激酶-1(ERK5/BMK1)和不经典的ERK3、ERK4、ERK7/8和NLK等八个亚家族。这些亚族组成多条信号通路,其中p38途径、ERK1/2途径和JNK/SAPK途径是研究最为广泛和深入,也是最为重要的MAPK信号通路。Mnk (MAPK signal-integrating kinase,简称Mnk)是p38 MAPK和ERK/MAPK信号途径的共同的下游激酶,最开始被认为是ERK的亚型,分别命名为Mnk 1和Mnk2。 Mnk 1/2通过对eIF4E的磷酸化(p-eIF4E)使肿瘤细胞具有抗凋亡、促进肿瘤相关蛋白质合成等作用。Mnk2是Mnk1的同源结构。研究发现,Mnk2和Mnk1一样与eIF4G结合形成复合物,通过对eIF4E第209号位点丝氨酸的磷酸化,使elF4E更容易与mRNA5’帽子结构结合进而增加mRNA的翻译能力。与Mnkl不同的是,Mnk2通过ERK和p38MAPK a/p途径进行eIF4E的磷酸化,而不是p38MAPK和JNK途径。无论是在体外还是在体内实验,Mnk2均比Mnk1表现出更高的生物活性,而且对上游p38MAPK或ERK信号通路的抑制作用相对不敏感。真核细胞翻译起始因子(eukaryotic translation initiation factor 4E, eIF4E),是真核细胞翻译起始和调控的核心成分,通过与mRNA5’端帽子结构结合,在蛋白质翻译起始过程中发挥重要作用。研究证实,在人类的多种恶性肿瘤中均发现在癌组织以及癌旁组织中存在eiF4E的过度表达,并且与肿瘤的侵袭转移能力呈正相关。非小细胞肺癌包括细支气管肺泡癌(BAC)患者p-eIF4E在癌组织细胞的表达远高于正常组织细胞,而且在NSCLC中过表达患者的5年生存率更低,p-eIF4E可以作为患者独立的预后因素。Rosenwald等的研究发现,eIF4E表达的增加很容易促进支气管肺泡癌的赘生细胞的生长和浸润。而Seki等通过对143例周围型肺腺癌和非典型腺瘤样增生进行eIF4E的免疫组化染色,发现肺腺癌组织eIF4E的表达明显高于正常组织,而且与肿瘤的组织学和浸润程度相关。由于Mnk1/2是MAPK的下游激酶,其通过对elF4E的磷酸化使肿瘤细胞具有抗凋亡,促进细胞增殖的作用,所以Mnk1/2的表达水平能反映出肿瘤细胞抗凋亡,侵袭,增殖等方面的能力。在乳腺癌的研究中,Mnk1/2的表达水平与HER2的过表达呈正相关,是肿瘤治疗的潜在靶点。但是,目前在全球范围内并没有关于Mnk1/2与肺癌方面的相关详细报道,是否与在乳腺癌的研究中一样,Mnk1/2高表达与细胞的增殖,侵袭,抗凋亡的能力相关；Mnk1/2蛋白表达水平与临床病例特征的关系如何,能否成为肺癌的一个独立预后因素,这些都需要进行更深入的研究。由于Mnk2(主要是Mnk2A)较Mnk1有更高的生物活性,且在我们前期的实验中发现,在肿瘤标本及肺癌细胞株中Mnk2有更高的表达水平,所以是近年来的研究热点也是我们的研究重点。我们拟通过对石蜡切片,非小细胞肺癌细胞株以及移植瘤动物模型三个方面对Mnk2进行检测,了解Mnk2在非小细胞肺癌中对预后的提示意义及其分子基础。第一章Mnk2蛋白表达水平与患者术后生存率及临床病理特征的关系研究方法：收集2006年10月至2009年6月经广州医科大学附属第一医院诊断的367例非小细胞肺癌病例的组织标本及其中117例癌旁正常肺组织。所有标本经常规HE染色,选取合适区域制作组织芯片蜡块,经免疫组化二步法检测MNK2蛋白的表达水平,按细胞着色范围及强度,根据中位数将MNK2表达水平分为低表达组及高表达组。研究结果：1.Mnk2蛋白表达定位于肿瘤细胞及支气管上皮细胞的胞浆,相对于癌旁组织,肺癌组织中Mnk2的蛋白表达水平明显升高,差异具有统计学意义(log-rank test, t=-11.397, P<0.001)。2.在367例非小细胞肺癌组织中,Mnk2蛋白高表达的有220例,高表达率为59.5%(220/367)。患者的5年总生存(OS)比率为45.74%,5年无病生存率(DFS)为43.83%。3.Mnk2低表达组(n=147)和高表达组(n=220)的OS比率分别为60.39%和36.01%,两组有显著性差异(log-rank test, X2=16.382, P<0.001); DFS比率分别为57.26%和35.04%,两组有显著性差异(log-rank test, X2= 16.982, P<0.001)。4.在早中期病例中(Ⅰ+Ⅱ期),Mnk2表达水平与病人预后有显著相关性,Mnk2低表达组(n=102)和高表达组(n=131)的5年生存率分别为67.43%和51.54%,两组有显著性差异(log-rank test, X2=5.123, P=0.024);5年无病生存率分别为66.30%和50.42%,两组有显著性差异(log-rank test, X2=5.058, P=0.025, P=0.025)。5.在晚期病例中(Ⅲ+Ⅳ期),Mnk2低表达组(n=45)和高表达组(n=89)的5年生存率分别为44.44%和13.18%,两组有显著性差异(log-rank test, X2=9.192, P=0.002);5年无病生存率分别为36.02%和12.56%,两组有显著性差异(log-rank test, X2=11.083, P=0.001)。6.在肺腺癌中,Mnk2低表达组(n=88)和高表达组(n=154)的5年生存率分别为61.22%和34.00%,两组有显著性差异(log-rank test, X2-12.255, P<0.001);5年无病生存率分别为57.79%和33.09%,两组有显著性差异(log-rank test, X2=12.041, P=0.001);而在肺鳞状细胞癌及大细胞癌中,Mnk2表达水平与患者术后生存率及无病生存率均没有相关性(P>0.05)。7.对367例病例行COX单因素回归分析表明,MNK2 (P<0.001, log-rank test)、年龄(P=0.017, log-rank test)、T分期(P=0.003, log-rank test)、N分期(P<0.001,log-rank test)及临床分期(P<0.001, log-rank test)均是非小细胞肺癌预后不良的指标。8.COX多重回归分析表明,Mnk2高表达(Hazard ratio= 1.832,95% confidence interval:1.358-2.472, P=0.003)、N分期(Hazard ratio=3.275,95% confidenceinterval:2.437-4.401, P<0.001)分别是非小细胞肺癌预后不良的独立指标之一。9.在367例病例中,应用X2检验分析显示,Mnk2的表达水平与N分期有显著相关性(P=0.008),而与年龄、性别、临床分期、组织类型、吸烟及T分期没有相关性(P>0.05)。10.检测174例非小细胞肺癌组织芯片的MNk2、eIF4E及P-eIF4E的蛋白表达,应用相关性Pearson correlation统计学分析,结果显示Mnk2与eIF4E(r=0.216, P=0.006)、P-eIF4E (r=0.241, P=0.002)的蛋白表达具有正性相关,MNK高表达伴随着eIF4E及P-eIF4E的高表达,MNK2低表达伴随着eIF4E及P-eIF4E的低表达。研究结论：1.Mnk2在非小细胞肺癌细胞组织中高表达,Mnk2蛋白定位于肿瘤细胞及支气管上皮细胞的胞浆。2.367例非小细胞肺癌患者Mnk2高表达组的生存率明显低于低表达组：3.临床分期Ⅰ-Ⅱ期(早,中期)及Ⅲ-Ⅳ期(中,晚期)非小细胞肺癌中Mnk2的表达水平与患者预后显著相关；4.肺腺癌中Mnk2的表达水平与患者预后显著相关；5.Mnk2高表达和N分期分别是非小细胞肺癌预后不良的独立指标之一;6.Mnk2的表达水平与N分期有显著相关性,而与年龄、性别、临床分期、组织类型、吸烟及T分期没有相关性。7.MNK2与eIF4E、P-eIF4E的蛋白表达具有正性相关。提示MNK2在MAPK通路中可能通过eIF4E及磷酸化eIF4E起作用。第二章MNK2在非小细胞肺癌细胞系中的表达及沉默后体外细胞功能实验研究方法：1.选择对数生长期的人非小细胞肺癌细胞株(A549、NCI-H460、NCI-H1975、 NCI-H520、NCI-H1650、SPC-A-1)以及正常支气管上皮细胞株16HBE,采用荧光定量PCR方法检测各细胞株中Mnk2的表达水平；2.Mnk2基因沉默采用化学合成的siRNA序列,序列为：sense 5’UCGUCAAGAUCAUUGAGAATT--3’及 anti-sense5’-UUCUCAAUGAUCUUGACGGTT-3’,转染A549, NCI-H460及NCI-H1975细胞株;3.使用Mnk2-siRNA和Negative control进行细胞体外功能实验,包括：CCK细胞增殖实验,平板克隆形成实验以及Transwell小室体外迁移实验；研究结果：1.在非小细胞肺癌细胞株(A549、NCI-H460、NCI-H1975、NCI-H520、SPC-A-1、 NCI-H1650)及正常支气管上皮细胞株(16HBE)中,NCI-H1975的Mnk2表达水平最高。应用两独立样本t检验表明与16HBE相比,Mnk2-mRNA在非小细胞肺癌细胞株NCI-H460、NCI-H1975、NCI-H520、A549及SPC-A-1中高表达(P<0.05, Independent-Samples t test)。单因素方差分析方差齐性检(LSD)显示MNK2在非小细胞肺癌细胞株及正常支气管上皮细胞株中的表达有显著差异(P*<0.001,F*值=43.494,)。2.免疫荧光检测非小细胞肺癌细胞株(A549、H1975、H460、SPC-A-1、H1650)及正常支气管上皮细胞株(16HBE)中Mnk2的蛋白表达水平,结果显示Mnk2在H1975、H460、A549三个细胞株中表达上调。而相对于16HBE,在SPC-A-1、H1650细胞中的表达降低。3.免疫印迹检测非小细胞肺癌细胞株H1975、H460、SPC-A-1、H1299、H1650)及正常支气管上皮细胞株(16HBE)中Mnk2的蛋白表达水平,结果显示Mnk2在H1975、H460、A549、H1299四个细胞株中表达上调。而相对于16HBE,在SPC-A-1、H1650细胞中的表达下调。4.采用荧光定量RT-PCR检测A549细胞中Mnk2-siRNA组及Negative control组中Mnk2的表达水平显示：Mnk2在Mnk2-siRNA组中的表达水平明显低于Negative control组,差异具有统计学意义(t=-13.742,P<0.001,Independent-Samples t test);5.采用荧光定量RT-PCR检测NC-H460细胞中Mnk2-siRNA组及Negative control组中Mnk2的表达水平显示：Mnk2在Mnk2-siRNA组中的表达水平明显低于Negative control组,差异具有统计学意义(t=-15.179,P<0.001)；6.采用荧光定量RT-PCR检测NCI-H1975细胞中Mnk2-siRNA组及Negative control组中Mnk2的表达水平显示：Mnk2在Mnk2-siRNA组中的表达水平明显低于Negative control组,差异具有统计学意义(t=--44.946,P<0.001)；7.采用CCK8法检测Mnk2在A549细胞的体外增殖能力。与Negative control组相比,Mnk2-siRNA组在第1、2、3、4天两组间的细胞生长速度明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05, Independent-Samples t test);8.采用CCK8法检测Mnk2在NCI-H460细胞的体外增殖能力。与Negative control组相比,Mnk2-siRNA组在第2、3、4、5天两组间的细胞生长速度明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05, Independent-Samples t test);9.采用CCK8检测Mnk2在NCI-H1975细胞的体外增殖能力。与Negative control组相比,Mnk2-siRNA组在第1、2、3、4、5天两组间的细胞生长速度明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05, Independent-Samples t test);10.利用平板克隆形成实验检测A549/Mnk2-siRNA细胞组及A549/Negative control细胞组体外增殖能力的变化,A549/Mnk2-siRNA细胞组的克隆形成数为24±4.041, A549/Negative control细胞组克隆形成数为164±5.132,两组细胞间克隆形成能力的差异有显著差异(t-=36.946,P<0.001,Independent-Samples t test);11.利用平板克隆形成实验检测NCI-H460/Mnk2-siRNA细胞组及NCI-H460/Negative control细胞组体外增殖能力的变化,NCI-H460/Mnk2-siRNA细胞组的克隆形成数为55±7.00, NCI-H460/Negative control细胞组克隆形成数为147±6.557,两组细胞间克隆形成能力的差异有显著差异(t=-16.613, P<0.001, Independent-Samples t test);12.利用平板克隆形成实验检测NCI-H1975/Mnk2-siRNA细胞组及NCI-H1975/Negative control细胞组体外增殖能力的变化NCI-H1975/Mnk2-siRNA细胞组的克隆形成数为31±4.583,NCI-H 1975/Negative control细胞组克隆形成数为118±6.000,两组细胞间克隆形成能力的差异有显著差异(t=-19.959, P<0.001, Independent-Samples t test);13.采用Transwell小室的方法检测转染Mnk2-siRNA或negative control后,A549细胞体外迁移能力的变化。与negative control组相比,Mnk2-siRNA组穿膜细胞数少于negative control组,差异具有统计学意义(t=-6.360,P=0.003,Independent-Samples t test);14.采用Transwell小室的方法检测转染Mnk2-siRNA或negative control后,NCI-H460细胞体外迁移能力的变化。与negative control组相比,Mnk2-siRNA组穿膜细胞数少于negative control组,差异具有统计学意义(t=-12.932, P<0.001, Independent-Samples t test);15.采用Transwell小室的方法检测转染Mnk2-siRNA或negative control后,NCI-H1975细胞体外迁移能力的变化。与negative control组相比,Mnk2-siRNA组穿膜细胞数明显少于negative control组,差异具有统计学意义(t=-5.480, P=0.005, Independent-Samples t test).研究结论：1.在肺癌细胞株中,Mnk2的表达水平明显高于正常支气管上皮细胞,提示Mnk2是肺癌信号通路中被激活的一类蛋白；2.在转染了Mnk2-siRNA的肺癌细胞株中,细胞增殖,细胞克隆能力及体外迁移能力受到抑制,提示Mnk2是恶性肿瘤发生,发展,侵袭和转移的重要因素之一。第三章Mnk2沉默后的动物实验研究方法：1.通过慢病毒转染A549及NCI-H460细胞的方法构建Mnk2-shRNA-A549及Mnk2-shRNA-H460;2.选用处于对数生长期的A549和NCI-H460细胞,转染慢病毒Mnk2-shRNA或negative control后使用DMEM培养基稀释到浓度为2×106/ml及3×106/ml;3.将细胞分别注射于裸鼠胁腹侧,4天后开始观察肿瘤大小,每3天记录一次,在适当时候处死裸鼠,剔出瘤体并称重,行石蜡包埋切片并行HE染色,显微镜下观察。4.将细胞经尾静脉注入裸鼠体内,接种3天后观察裸鼠状态,30天时处死裸鼠,取肝脏组织观察其表面成瘤数目。研究结果：1.在注射的A549细胞株的各7只裸鼠中,NC组的所有裸鼠均成瘤,Mnk2-shRNA组只有6只(85.7%)裸鼠成瘤,成瘤时间在第10天后。两组成瘤速度统计学有显著差异P<0.05,Independent-Samples t test)。处死裸鼠后,A549细胞株Mnk2-shRNA组瘤重0.05±0.049g,小于NC组瘤重(0.149±0.722g)(t=-2.976, P=0.012, two-independent t test);2.在注射的NCI-H460细胞株的各7只裸鼠中,NC组的所有裸鼠均成瘤,Mnk2-shRNA组只有6只(85.7%)裸鼠成瘤,成瘤时间在第7天后。Mnk2-shRNA组的成瘤速度比NC组成瘤速度慢,但两组的成瘤速度之间除了第7天统计学有显著差异(P=0.031, Independent-Samples t test)之外,之后的肿瘤体积无统计学意义(P>0.05, Independent-Samples t test)。处死裸鼠后,NCI-H460细胞株Mnk2-shRNA组瘤重0.217±0.152g,小于NC组瘤重(0.343±0.078g),但统计学没意义(t=-1.947, P=0.075, Independent-Samples t test);3.在注射A549细胞株的各5只裸鼠中,Mnk2-shRNA组的所有裸鼠肝脏转移瘤数(3±1个)比NC组的肝脏转移瘤数(10±3个)明显减少,两组成瘤速度统计学有显著差异(t=-5.259, P=0.001, Independent-Samples t test);4.在注射的NCI-H460细胞株的各6只裸鼠中,Mnk2-shRNA组的所有裸鼠肝脏转移瘤数(4±1个)比NC组的肝脏转移瘤数(19±11个)明显减少。两组成瘤速度统计学有显著差异(t=-3.415, P=0.018, Independent-Samples t test)。研究结论：1.在皮下注射转染了Mnk2-shRNA的A549细胞株后能显著抑制裸鼠皮下成瘤的速度,提示针对Mnk2的基因沉默能抑制肿瘤的生长,但是在NCI-H460细胞中没有得到预期的结果,需要更多的实验数据去进一步说明；2.在尾静脉注射转染Mnk2-shRNA的A549和NCI-H460细胞株能够抑制肿瘤的转移能力,提示针对Mnk2的基因沉默能抑制肿瘤的转移；