【摘 要】
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根据实验室从长白山白眉蝮蛇中纯化的磷脂酶A的N端氨基酸测序和肽质谱分析结果,设计特异性引物,通过3-RACE和RT-PCR分离出了编码该蛋白的基因.该基因含有366个核苷酸,编码122个氨基酸.氨基酸序列分析和三级结构模拟表明,分离得到的脂酶A具有第Ⅱ类磷脂酶A的典型结构;分离得到的磷脂酶A位氨基酸残基是Gln,是一种新的磷脂酶A,命名为Gln49-PLA;Gln49-PLA没有磷脂酶A的活性,可
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根据实验室从长白山白眉蝮蛇中纯化的磷脂酶A<,2>的N端氨基酸测序和肽质谱分析结果,设计特异性引物,通过3-RACE和RT-PCR分离出了编码该蛋白的基因.该基因含有366个核苷酸,编码122个氨基酸.氨基酸序列分析和三级结构模拟表明,分离得到的脂酶A<,2>具有第Ⅱ类磷脂酶A<,2>的典型结构;分离得到的磷脂酶A<,2>位氨基酸残基是Gln,是一种新的磷脂酶A<,2>,命名为Gln49-PLA<,2>;Gln49-PLA<,2>没有磷脂酶A<,2>的活性,可能是Gln残基与钙离子的电荷不相容而干扰了钙离子的结合所致.磷脂酶A<,2>的序列对比分析结果表明,Gln49-PLA<,2>和Asp49-PLA<,2>s的同源性(93%-61%)要高于Lys49-PLA<,2>s(60%-56%);进化树分析结果也表明,Gln49-PLA<,2>和Asp49-PLA<,2>s的亲缘关系要近于Lys49-PLA<,2>s.将Gln49-PLA<,2>基因克隆到表达载体pET-32a(+)中,经热激转化大肠杆菌BL21(DE3),通过IPTC诱导,Gln49-PLA<,2>基因在大肠杆菌中得到了可溶性表达.Westernblot显示,纯化后的目的蛋白能与天然Gln49-PLA<,2>免疫得到的鸡抗Gln49-PLA<,2>免疫球蛋白(IgY)产生抗原-抗体反应.优化培养条件表明在30℃诱导6小时,Gln49-PLA<,2>得到了较高水平的可溶性表达,目的蛋白在可溶组分中相对含量达到19.6%.通过固定化金属亲和层析、阴离子交换、疏水层析融合蛋白得到了纯化,其纯度可达91%.重组Gln49-PLA<,2>具有明显的抗凝血活性,并对Hela细胞的生长有抑制作用,其IC<,50>为2.8μmol/L.
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