平滑肌型括约肌是一类特化的环形平滑肌，分布于消化道系统、泌尿生殖系统、循环系统和虹膜等管道或室口的末端。括约肌最为显著的特性是可以产生自发性张力，这对于控制食物、血液、粪便、尿液或其他物质的流动起着重要的作用。肛门内括约肌是能够产生自发张力的典型紧张型平滑肌，其自发张力的调节在肛门直肠节欲中起着至关重要的作用。肛门内括约肌自发张力降低会引起失禁，张力过高会引起便秘或其他肛门直肠能动性紊乱疾病如痔疮和反复性肛裂等。在本篇研究中，以肛门内括约肌为模型探讨平滑肌自发张力产生的机制。　　在不加任何外界刺激剂的情况下，括约肌可以产生自发张力是其最为显著的收缩特性。虽然针对此特性，很多信号通路已经提出，但是自发张力产生机理依然不清楚。目前的研究表明，至少有三种机制可能参与了肛门内括约肌收缩调控。第一种是蛋白激酶C激活CPI-17直接作用于肌球蛋白轻链磷酸酶(MLCP)的催化亚基，介导的自发张力形成;第二种是钙离子依赖性的肌球蛋白轻链激酶(MLCK)活性升高或者RhoA/ROCK磷酸化轻链磷酸酶的调节亚基(MYPT1)引起的肌球蛋白轻链磷酸酶(MLCP)活性抑制，导致的肌球蛋白轻链磷酸化对肛门内括约肌自发张力的调控。最后一种是钙离子非依赖性的肌球蛋白轻链激酶，比如Zipper interacting protein kinase(ZIPK)或者integrin-linked kinase(ILK)参与盼调控。这些存在争议的机制往往通过药理学研究和观察提出。在本课题中，我们通过遗传动物模型对肛门内括约肌自发张力产生机制进行探讨。　　首先，我们建立了ZIPK平滑肌特异性缺失的敲除小鼠并分析了其在肛门内括约肌中的功能。结果表明，平滑肌特异性敲除ZIPK并不影响肛门内括约肌自发张力的产生。我们的表型分析和其他平滑肌的张力测定结果也表明ZIPK在正常的生理状态下对平滑肌的收缩调控并非必须的。因此，我们的结论为ZIPK并不参与肛门内括约肌自发张力的产生。然后，我们分析了平滑肌特异性敲除MLCK的Mlckflox/flox; CreERT2小鼠IAS自发张力的产生。肛门内括约肌自发张力的产生、氯化钾去极化和激动剂诱导的收缩以及肌球蛋白轻链的磷酸化，在平滑肌特异性敲除MLCK的小鼠中完全消失了。力动力学分析表明，肛门内括约肌中的MLCK含量跟自发张力的产生呈线性关系，跟氯化钾和氯贝胆碱诱导的收缩呈对数关系。大约20％的MLCK可以产生刺激诱发的最大收缩，却只能产生很低的自发张力。　　虽然已经报道MYPT1在平滑肌收缩的调节中起着重要作用，我们的结果表明自发张力的产生、氯化钾去极化和激动剂诱导的收缩在MYPT1缺失的肛门内括约肌中并没有受到影响。这些结果同时暗示钙离子依赖的MLCK和轻链磷酸化在自发张力的产生中起更重要作用。现在的问题是，MLCK在没有受到刺激的肛门内括约肌细胞中是怎么被激活的？在某些平滑肌中，肌浆网上Ryanodine受体的开放可以在局部产生自发的钙信号，定义为钙火花。这些钙火花可以打开钙离子激活的氯通道从而产生内向电流导致膜的去极化。钙火花引起的去极化可以打开电压门控的钙离子通道，引起全局钙离子的增加。因此，我们提出的假说是Ryanodine Receptor-Calcium Spark-Calcium-ChlorideChannel-L type Channel-Calcium Influx-MLCK信号通路参与了肛门内括约肌中自发张力的产生。为了验证上述假说，我们测定了Ryanodine受体在组织水平的表达。我们分别在组织和细胞水平发现肛门内括约肌Ryr1的表达和Ryanodine激动剂咖啡因的敏感性明显高于其相邻的直肠平滑肌(RSM)。其次，同我们的预期一样，Ryanodine受体的抑制剂Ryanodine和激动剂咖啡因分别可以降低或者升高IAS的自发张力。我们的结果也表明通过ryanodine受体产生的钙火花的频率和细胞的长短呈负相关性，钙火花活性越高，细胞长度越短。电生理的实验进一步表明通过ryanodine受体释放的钙离子可以激发膜上的一个氯通道，从而产生内向电流，引起膜的去极化和打开周围的L-型钙通道。　　综上所述，我们主要通过遗传学研究揭示了IAS中自发张力产生的机制并提出了一条依赖于肌球蛋白轻链磷酸化的信号传导通路。在此通路中，Ryr1受体/钙火花介导的钙离子内流对MLCK的激活参与自发张力的产生，MLCP活性的抑制参与自发张力的维持。