研究背景：　　 登革病毒(dengue virus,DENV)为黄病毒属单正股RNA病毒,分1、2、3、4等四个血清型。登革病毒疾病是一类由DENV引起的,主要由蚊媒传播的,严重危害人类健康的病毒性传染病。近年来DENV感染在全球范围,尤其在热带、亚热带地区呈逐年上升趋势,流行区域正在扩大,已成为世界上危害较大的一种虫媒病毒病,是全球重要的公共卫生问题。　　 DENV感染所致疾病包括从较轻的登革热(dengue fever,DF)到严重致死性的登革出血热(dengue hemorrhagic fever,DHF),以及登革休克综合症(dengueshock syndrome,DSS)。血浆渗漏和出血症状是DHF/DSS重要的临床特征,DHF/DSS的主要病理生理改变包括:(1)血管通透性增加,患者出现白细胞数量和功能改变、红细胞压积增加、血小板减少及凝血障碍。(2)血浆渗漏是DHF的主要临床表现,一般出现在退热期；血浆大量进入腔隙中,血容量减少、血液浓缩、血压降低,最终导致休克,引发DSS。有关DHF/DSS的致病机制目前仍不清楚。　　 NS1是DENV重要的非结构蛋白,在细胞感染过程中,以可溶性形式存在于感染细胞内或细胞表面。NS1是一种高度保守的糖蛋白,是病毒生存所必需的,但是其确切功能还不清楚。以往研究表明NS1可能与病毒感染宿主的血小板、血管内皮细胞等具有相似的抗原决定簇,登革病毒可能通过分子模拟机制导致疾病的发生；然而NS1具体的致病机制目前并未阐明。　　 研究目的：　　 登革病毒致感染宿主发生DHF/DSS的免疫病理机制目前仍不清楚,以往研究表明NS1可能在此免疫病理过程中发挥重要作用,但其具体机制仍有待研究。本研究构建抗NS1抗体和NS1特异性T细胞,从体液免疫和细胞免疫两个方面系统地探讨NS1致病毒感染宿主血小板减少和血管渗漏的免疫病理机制,为进一步揭示DHF/DSS的病理机制奠定基础。　　 研究方法：　　 一、抗NS1抗体介导的免疫病理作用研究　　 1.DENV2 NS1的表达和纯化　　 采用毕赤酵母表达系统表达DENV2 NS1,6×His标签树脂过滤柱纯化NS1,免疫印迹法鉴定NS1。　　 2.抗NS1抗体制备　　 NS1加弗氏完全佐剂多点注射免疫BAL B/c小鼠,然后用NS1加弗氏不完全佐剂多次腹腔注射加强免疫以获得抗NS1多克隆抗体,ELISA法检测其抗体效价。　　 3.抗NS抗体的体外免疫病理作用研究　　 3.1流式细胞术检测抗NS1抗体与血小板交叉反应性,免疫荧光法检测抗NS1抗体与血管内皮细胞(Human microvascular endothelial cell1,HMEC-1)交叉反应性。　　 3.2抗NS1抗体与HMEC-1细胞共培养,加入BAL B/c小鼠新鲜血清,ELISA法检测培养上清中C3a、C4a、C5a、sC5b-9等补体活性成分含量。　　 3.3 HMEC-1细胞爬片培养,加入抗NS1抗体和BAL B/c小鼠新鲜血清,免疫荧光法检测膜攻击复合体(membrane attack complex,MAC)在HMEC-1细胞爬片上的定位。　　 4.抗NS抗体的体内疫病理作用研究　　 4.1尾静脉注射抗NS1抗体过继免疫BAL B/c小鼠。　　 4.2显微镜计数过继免疫小鼠外周血血小板数量,HE染色法观察其血管组织结构损伤及炎性细胞浸润状况。　　 4.3免疫组织化学法检测抗NS1抗体与过继免疫小鼠血管内皮细胞交叉反应性。　　 4.4 ELISA法检测过继免疫小鼠外周血C3a、C4a、C5a、sC5b-9等补体活性成分含量。　　 二、NS1特异性T细胞介导的免疫病理作用研究　　 1.NS1特异性T细胞系的建立　　 1.1采用间歇循环刺激和有限稀释法建立NS1蛋白特异性T细胞系。　　 1.2 MTT法分析T细胞系的抗原特异性。　　 1.3流式细胞术分析T细胞系的表型特征。　　 2.NS1特异性T细胞的体外免疫病理作用研究　　 2.1 NS1刺激培养NS1特异性T细胞,ELISA法检测培养上清中IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ和TNF-α等细胞因子含量。　　 2.2 NS1特异性T细胞与HMEC-1细胞共培养,免疫组织化学法分析HMEC—1细胞凋亡相关蛋白Fas、FADD、Caspase3、Caspase8的表达水平,流式细胞术检测HMEC-1细胞凋亡率。　　 3.NS1特异性T细胞的体内疫病理作用研究　　 3.1尾静脉注射NS1特异性T细胞过继免疫BAL B/c小鼠。　　 3.2显微镜计数过继免疫小鼠外周血血小板数量,HE染色法观察其血管组织结构损伤及炎性细胞浸润状况。　　 3.3流式细胞术检测过继免疫小鼠外周血血小板凋亡蛋白Fas的表达,比色法测定血管组织凋亡相关蛋白Caspase3、Caspase8的活性。　　 3.4 ELISA法测定过继免疫小鼠外周血Th1型细胞因子(IFN-γ)、Th2型细胞因子(IL-4)、免疫下调因子(IL-10)和肿瘤坏死因子(TNF-α)含量。　　 研究结果：　　 一、抗NS1抗体介导的免疫病理作用研究　　 1.DENV2 NS1的表达和纯化　　 本研究获得了纯化的DENV2 NS1,可用于后续试验。　　 2.抗NS1抗体制备　　 NS1加弗氏佐剂免疫BAL B/c小鼠,获得了高效价的抗NS1多克隆抗体。　　 3.抗NS抗体的体外免疫病理作用研究　　 3.1抗NS1抗体与血小板和血管内皮细胞有交叉反应性。　　 3.2抗NS1抗体与血管内皮细胞(HMEC-1)共培养体系可有效激活补体系统,产生过敏毒素C3a、C4a、C5a,形成MAC并定位在HMEC-1细胞膜上。　　 4.抗NS1抗体的体内疫病理作用研究　　 4.1抗NS1抗体过继免疫BAL B/c小鼠,可导致免疫小鼠外周血血小板数量减少,可介导炎性细胞在血管组织浸润并损伤血管组织结构,造成血管渗漏。　　 4.2抗NS1抗体与过继免疫BAL B/c小鼠血管内皮细胞有交叉反应性。　　 4.3抗NS1抗体过继免疫BAL B/c小鼠,可有效激活补体系统,产生过敏毒素C3a、C4a、C5a,以及可溶性MAC。　　 二、NS1特异性T细胞介导的免疫病理作用研究　　 1.NS1特异性T细胞系的建立　　 本研究获得了NS1特异性T细胞系,主要为CD4+T细胞,即辅助/诱导性T细胞,所有细胞均高表达死亡配体分子FasL。　　 2.NS1特异性T细胞的体外免疫病理作用研究　　 2.1 NS1特异性T细胞在NS1蛋白刺激下,可分泌大量的IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ和TNF-α等细胞因子。　　 2.2 NS1特异性T细胞可导致共培养的HMEC-1细胞凋亡率和凋亡相关蛋白Fas、FADD、Caspase3、Caspase8表达水平增加。　　 3.NS1特异性T细胞的体内疫病理作用研究　　 3.1 NS1特异性T细胞过继免疫BAL B/c小鼠,可导致免疫小鼠外周血血小板数量减少,可介导炎性细胞在血管组织浸润并损伤血管组织结构,造成血管渗漏。　　 3.2 NS1特异性T细胞过继免疫BAL B/c小鼠外周血血小板凋亡蛋白Fas表达增加,血管组织凋亡相关蛋白Caspase3、Caspase8的活性增加。　　 3.3 NS1特异性T细胞过继免疫BAL B/c小鼠外周血Th1型细胞因子(IFN-γ)和Th2型细胞因子含量增加(IL-4),免疫下调因子(IL—10)含量降低,肿瘤坏死因子(TNF-α)含量增加。　　 研究结论：　　 DENV2 NS1可诱导抗NS1抗体产生,这种抗NS1抗体可通过分子模拟机制与病毒感染宿主的血管内皮细胞和血小板非特异性结合,有效激活补体系统,生成大量毒性补体成分和攻膜复合体,直接和(或)间接作用于血管内皮细胞和血小板,导致血管内皮细胞和血小板损伤,在DHF/DSS的免疫病理机制中发挥重要作用。　　 DENV2 NS1可诱导其抗原特异性T细胞产生,这种NS1特异性T细胞可通过FasL-Fas途径介导血小板和血管内皮细胞凋亡而导致出血和血管渗漏,也可通过分泌多种炎性细胞因子直接或间接作用于血小板和血管内皮细胞凋亡而导致出血和血管渗漏,在DHF/DSS的免疫病理机制中发挥重要作用。